王天星，李 勇，李 迪，張 亭，珠 娜，杜 倩，烏 蘭，劉 睿

(北京大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，北京 100191)

糖尿病的諸多并發(fā)癥是導致患者傷殘的重要因素。目前研究發(fā)現(xiàn)，作為一種海洋生物活性肽，海參肽具有多種生物活性功能，王洪濤等[3]通過采用不同濃度的海參肽灌胃，研究海參肽對小鼠的抗疲勞作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海參肽能明顯延長小鼠的負重游泳時間和轉(zhuǎn)棒時間，顯著降低運動后小鼠的血尿素氮含量，提高肝糖原含量，表明海參肽具有明顯的抗疲勞功效。謝永玲等[4]使用42、83、250mg/kg海參肽每日灌胃小鼠30d，結(jié)果表明，83、250mg/kg海參肽可顯著提高小鼠單核—巨噬細胞吞噬指數(shù)、NK細胞活性，250mg/kg海參肽還可顯著提高小鼠半數(shù)溶血值和溶血空斑數(shù)，表明海參肽對小鼠體液免疫功能、非特異性免疫功能和NK細胞活性均有明顯的增強作用。目前研究表明，在2型糖尿病的發(fā)病機制中，炎癥反應占有十分重要的作用[5-10]，2型糖尿病的發(fā)病通常伴隨有炎癥反應急性期的反應標志物的升高，如C-反應蛋白、IL-6、IL-8等[11]，而國外研究表明，這些炎癥反應因子或直接或間接參與了2型糖尿病的胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[12]。國外學者Festa等[8]在研究胰島素抵抗與動脈粥樣硬化的人群實驗中發(fā)現(xiàn)，在健康非糖尿病人群中，C-反應蛋白與體內(nèi)胰島素的敏感性呈獨立負相關，從而推測出炎癥反應相關因子與胰島素抵抗有關；另有研究表明，在2型糖尿病的病程中，機體內(nèi)的組織會受到炎癥因子的攻擊，這會誘導激活體內(nèi)胰島B細胞的免疫反應[14]，此外，炎癥反應還會導致異位脂肪在肌肉、肝臟和胰腺等組織中的累積，從而正反饋的造成脂肪進一步分解，游離的脂肪酸增加，導致胰島素抵抗和炎癥的惡性循環(huán)。在炎癥反應中，巨噬細胞分泌的細胞因子如TNF-α、IL-6等可以誘導體內(nèi)存儲三酰甘油，加速脂肪的分解，產(chǎn)生更多的游離脂肪酸。研究表明，在2型糖尿病患者的血漿中，TNF-α和IL-6的水平明顯升高[15]，這表明炎癥因子在2型糖尿病的胰島素抵抗中產(chǎn)生了十分重要的影響。同時，TNF-α還會抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運體4的表達，直接導致機體的胰島素抵抗[16]。而另一種炎癥因子IL-6，目前研究認為是通過STAT3—SOCS3信號通路影響胰島素受體信號通路的傳導，從而導致機體的胰島素抵抗。本研究從db/db小鼠海參肽灌胃入手，對其可能存在的降糖作用以及炎癥反應程度影響進行探究，從動物體征、尿量、空腹血糖、口服葡萄糖耐量、血液生化指標等方面觀察不同濃度海參肽對2型糖尿病db/db小鼠的影響，為海參肽在2型糖尿病領域的合理使用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與受試物

SPF級雄性空腹血糖水平≥11.1mmol/L的db/db型糖尿病小鼠及與之周齡、性別匹配的非糖尿病的健康同窩出生仔畜(db/m小鼠，lepr-/m)，10～12w齡，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。以美國營養(yǎng)學會(AIN-93G)動物飼料作為基礎飼料。海參肽(低聚肽含量≥91%)，由吉林肽谷生物工程有限責任公司提供。

1.2 分組與干預

選取48只空腹血糖水平≥11.1mmol/L的db/db小鼠，按空腹血糖水平隨機分為6組：1個模型對照組、1個陽性對照組(鹽酸二甲雙胍腸溶片225mg/kg· BW)、1個乳清蛋白組、3個海參肽劑量組(0.25、0.50、1.00g/kg· BW)，每組8只。另取10只db/m小鼠作為正常對照組。連續(xù)灌胃給藥45d(表1)。

表1 實驗動物分組與干預劑量

1.3 儀器

安穩(wěn)血糖儀，三諾公司；安穩(wěn)血糖試紙，三諾公司。

1.4 指標檢測

(1)一般指標：每周監(jiān)測體重，并記錄飲食、身體狀況和精神狀態(tài)。(2)攝食量和飲水量檢測：分別于實驗前、中、后期用小鼠代謝籠監(jiān)測小鼠24h攝食量和飲水量。(3)隨機血糖檢測：實驗開始0w起，每隔2w監(jiān)測隨機血糖。(4)空腹血糖檢測：分別于實驗前、中、后期測定空腹血糖。(5)口服葡萄糖耐量實驗：分別于實驗前、后期進行口服葡萄糖耐量實驗。(6)尿液收集：分別于實驗前、中、后期將小鼠分別置于代謝籠中，收集24h尿液，尿液采集后，立即混勻，取少量尿液立即監(jiān)測其中尿白蛋白、尿肌酐的含量，其余尿液置于-80℃冰箱，冷凍保存。(7)血清生化指標檢測：實驗結(jié)束時，摘眼球采血，取血清，檢測IL-6、IL-8、IL-10、TGF-α、MCP-1水平(每個指標10μL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參肽對小鼠體征的影響

干預前，正常對照組小鼠(db/m)毛色黑亮有光澤，精神狀態(tài)良好，靈活好動，飲食正常。2型糖尿病模型小鼠(db/db)皮毛松散，體表發(fā)濕，精神狀態(tài)較差，活動量明顯少于正常組，有“多飲、多食、多尿”癥狀。干預后，正常對照組小鼠(db/m)未有明顯變化，2型糖尿病模型小鼠毛色及精神狀況逐漸有所好轉(zhuǎn)，活動量有所增加，干預時期內(nèi)極少出現(xiàn)感染癥狀(如尿道感染等)，其中以海參肽高劑量組最為明顯。實驗期間，海參肽中劑量組小鼠后期死亡2只。

2.2 海參肽對小鼠飲水量、攝食量及尿量的影響

從表2～4中可以看出，干預前，各模型組的飲水量、攝食量及尿量均高于正常對照組(db/m)小鼠，模型對照組小鼠籠內(nèi)墊料潮濕；隨著干預時間的增加，海參肽低、中、高組較空白對照組的飲水量、攝食量及尿量均有所下降，陽性對照組較空白對照組的飲水量、攝食量及尿量均顯著下降，這提示了海參肽能夠改善2型糖尿病小鼠的生活質(zhì)量，其中，海參肽高劑量組最為明顯。

表2 干預各時期各組平均飲水量 單位：mL

表3 干預各時期各組平均攝食量 單位：g

表4 干預各時期各組平均尿量 單位：mL

2.3 海參肽對小鼠空腹血糖的影響

由表5可見，與正常對照組小鼠相比，干預前，2型糖尿病小鼠空腹血糖均明顯高于正常組小鼠，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；干預中期，同組橫向?qū)Ρ戎?，陽性對照組和海參肽中劑量組的空腹血糖明顯降低，而到了干預后期，陽性對照組和海參肽高、中劑量組的空腹血糖均有所下降，其統(tǒng)計學差異具有顯著性(P<0.05)，海參肽低劑量組空腹血糖有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學差異，提示一定濃度的海參肽對2型糖尿病小鼠有較好的降糖作用。

2.4 海參肽對小鼠口服葡萄糖耐量的影響

由表6可見，在干預后期的口服葡萄糖耐量實驗中，模型組給予葡萄糖前后各時間點的血糖值及血糖—時間曲線下面積(AUC)均高于正常對照組，證明糖耐量為異常；與模型對照組相比，海參肽中、高劑量組在口服葡萄糖前后的血糖以及AUC均顯著降低，該差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。海參肽低劑量組較模型對照組血糖及AUC有少量下降，但差異不具有統(tǒng)計學意義。這表明中、高劑量海參肽可改善2型糖尿病小鼠受損的糖耐量，且可以改善2型糖尿病小鼠用餐后2h的血糖值。

2.5 海參肽對小鼠炎癥反應的影響

由表7可見，2型糖尿病小鼠的IL-6、IL-8均高于正常組小鼠水平，IL-10低于正常組小鼠，這與糖尿病易發(fā)炎癥的癥狀相符合，干預后與模型對照組相比，海參肽中、高劑量組的IL-6、IL-8水平均有所降低，IL-10水平有所提高，其差異具有統(tǒng)計學意義，這說明海參肽能有效降低糖尿病小鼠的炎癥反應，從而減弱小鼠體內(nèi)的胰島素抵抗。同時，干預后海參肽中、高劑量組的TGF-α、MCP-1較之模型對照組有所降低，這意味著海參肽對于TGF-α在體內(nèi)的分泌具有一定的抑制作用。

表5 給藥前后各組小鼠血糖情況變化

注：a與空白對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)；b與給藥前同組血糖比較，差異有顯著性(P<0.05)

表6 干預后期口服葡萄糖耐量的影響

注：a與空白對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)；b與模型對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)

表7 海參肽對炎癥反應的影響

注：a與空白對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)；b與模型對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)

3 討論

本次實驗采用的模型為db/db小鼠，是由C57BL/KsJ近親交配株常染色體隱性遺傳衍化而來，屬2型糖尿病模型。純合的自發(fā)突變小鼠在3～4w齡時產(chǎn)生可以辨認的肥胖表型。出生后10～14日，血漿胰島素和血糖開始升高，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿的“三多”癥狀，其存活壽命為10個月左右，適合用于外物干預下的糖尿病降糖作用研究。從降糖作用的實驗結(jié)果來看，db/db 2型糖尿病小鼠經(jīng)過海參肽灌胃干預后，小鼠毛色由稀疏暗淡逐漸變得茂密有光澤，籠內(nèi)墊料較干預前潮濕度有所減少，多飲、多尿、多食的“三多”癥狀也逐漸好轉(zhuǎn)，干預6w后的空腹血糖與模型對照組相比逐漸下降，加之干預后期口服葡萄糖耐量實驗，說明了一定濃度特別是高濃度的海參肽口服能夠有效降低空腹血糖，改善異常糖耐量，提高糖尿病人的生活質(zhì)量，一定程度上遏制了糖尿病病情的加重。

從炎癥作用影響的實驗結(jié)果來看，干預組小鼠的IL-6、IL-8較之模型對照組均有所降低，一般來說，機體炎癥反應越激烈，IL-6、IL-8在體內(nèi)的表達量越高，高濃度的海參肽可以有效降低小鼠體內(nèi)IL-6、IL-8的表達，降低炎癥反應，從而減弱胰島素抵抗效應。IL-10是一種多功能負性調(diào)節(jié)因子，在自身免疫性疾病、嚴重感染性疾病、腫瘤及移植免疫等多種疾病中發(fā)揮重要作用，高濃度的海參肽可以促進小鼠體內(nèi)IL-10的表達，從而抑制炎癥的發(fā)生。海參肽可以有效降低TGF-α、MCP-1在體內(nèi)的表達，從而負反饋調(diào)節(jié)機體的炎癥反應，有效地降低胰島素抵抗的發(fā)生。

綜上所述，本實驗結(jié)果提示海參肽能夠有效地改善2型糖尿病小鼠的血糖調(diào)節(jié)，提升2型糖尿病小鼠的體征狀態(tài)、生活質(zhì)量以及口服糖耐量的調(diào)節(jié)，并且一定程度上能夠降低2型糖尿病小鼠的炎癥反應水平，減少可能隨之出現(xiàn)的并發(fā)癥，其中高濃度海參肽的效果最為穩(wěn)定有效，在糖尿病的防治以及預防炎癥并發(fā)方面具有一定的應用價值。本實驗為海參肽在糖尿病方面的充分利用提供了科學依據(jù)，為海參肽的合理利用提供了新的參考。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)了海參肽在降低2型糖尿病的炎癥反應方面的潛能，為進一步研究海參肽的抗炎癥作用機制提供了可靠的依據(jù)?！?/p>

[1]趙芹.海參膠原蛋白多肽抗氧化活性的研究[D].中國海洋大學，2008.

[2]Shaw JE，Sicree RA，Zimmet PZ.Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030[J].Diabetes Res Clin Pract，2010，87(1)：4-14.

[3]王洪濤，尹花仙，金海珠，等.海參肽對小鼠抗疲勞作用的研究[J].食品與機械，2007，27(3)：89-91.

[4]謝永玲，張明月，張靜，等.海參肽對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國海洋藥物，2009，28(4)：43-45.

[5]Pickup JC，Mattock MB，Chusney GD，et al.NIDDM as a disease of the innate immune system：association of acute phase reactants and interleukin-6 with metabolic syndrome X[J].Diabetologia，1997，40(11)：1286-1292.

[6]Schmidt MI，Duncan BB，Sharrett AR，et al.Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults(Atherosclerosis Risk in Communities study)：a cohort study[J].Lancet，1999，353(9165)：1649-1652.

[7]Festa A，D.Agostino R Jr，Howard G，et al.Chronic subclinical inflammation as part of the insulin resistance syndrome：the Insulin Resistance Atherosclerosis Study(IRAS)[J].Circulation，2000，102(1)：42-47.

[8]Festa A，D.Agostino R Jr，Tracy RP，et al.Elevated levels of acutephase proteins and plasminogen activator inhibitor-1 predict the development of type 2 diabetes[J].Diabetes，2002，51(4)：1131-1137.

[9]Pradhan AD，Manson JE，Rifai N，et al.C-reactive protein，interleukin 6，and risk of developing type 2 diabetes mellitus[J].Jama，2001，286(3)：327-334.

[10]Barzilay JI，AbrahamL，Heckbert SR，et al.The relation of markers of inflammation to the development of glucose disorders in the elderly：the Cardiovascular Health Study[J].Diabetes，2001，50(10)：2384-2389.

[11]Vozarova B，Weyer C，Lindsay RS，et al.High white blood cell count is associated with a worsening of insulin sensitivity and predictsthe development of type 2 diabetes[J].Diabetes，2002，251(2)：455-461.

[12]Stienstra R，van Diepen J A，Tack C J，et al.Inflammasome is a central player in the induction of obesity and insulin resistance[J].Proc Natl Acad Sci，2011，108(37)：15324-15329.

[13]Zhou W，Yang P，Liu L，et al.Transmembrane tumor necrosis factor-alpha sensitizes adipocytes to insulin[J].Mol Cell Endocrinol，2015，406(5)：78-86.

[14]鐵璐等.糖尿病傷口愈合的分子機制[J].生理科學進展，2010，41(6)：407-412.

[15]Zhang，Z，et al.Oral administration of skin gelatin isolated from Chum salmon(Oncorhynchus keta)enhances wound healing in diabetic rats[J].Marine Drugs，2011，9(5)：696-711.

[16]Brem H，Tomic-Canic M.Cellular and molecular basis of wound healing in diabetes[J].J C lin Invest，2007(117)：1219-1222.

[17]王尊，何書勵，李振水，等.綜合營養(yǎng)干預對改善2型糖尿病患者血脂、血糖效果評價研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2017，23(8)：81-88.