李仲均，黃麗姍，黃素然

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 東莞 523059)

子癇前期是妊娠期特有的疾病，以妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕卣鳌Ｔ谖鞣桨l(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率約為2%～8%[1]，在我國(guó)發(fā)病率約為9.4%～10.4%[2]。子癇前期是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和新生兒患病率和死亡率升高的重要原因之一。在全球范圍內(nèi)，每年約有5萬(wàn)例孕產(chǎn)婦死于該疾病及其并發(fā)癥[3]。子癇前期的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，可能涉及遺傳易感性、營(yíng)養(yǎng)缺乏、血管內(nèi)皮損傷、炎癥免疫過(guò)度激活等多種因素[4]。其中血管內(nèi)皮損傷，被認(rèn)為是導(dǎo)致子癇前期發(fā)生和發(fā)展的重要因素[5]。半乳糖凝集素-1(Galectin-1)屬于β-半乳糖苷結(jié)合蛋白家族成員，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)細(xì)胞黏附等多種生物學(xué)功能[6]。近年的研究[7]表明，Galectin-1在參與調(diào)控細(xì)胞分化、新生血管形成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中起重要作用。Galectin-1在子癇前期疾病過(guò)程中的作用少見報(bào)道。本研究通半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(SqRT-PCR)法、免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Galectin-1在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)，探討其與子癇前期疾病發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014年1月至2015年9月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院住院分娩的子癇前期患者40例，均符合子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，其中輕度子癇前期(輕度組)25例，年齡(27.3±3.6)歲，孕次(2.3±1.2)次，孕周(28.2±1.2)周；重度子癇前期(重度組)15例，年齡(29.2±3.2)歲，孕次(2.1±1.6)次，孕周(28.5±1.3)周。選擇同期在本院住院分娩的正常妊娠孕婦(正常對(duì)照組)40例，年齡(29.1±4.5)歲，孕次(2.2±1.3)次，孕周(29.3±3.5)周。均無(wú)高血壓、糖尿病、腎病，以及其他產(chǎn)科并發(fā)癥。3組年齡、孕次、孕周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器

山羊抗人Galectin-1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，小鼠抗人CD34單克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，EnVisionTM+System購(gòu)自丹麥DAKO公司，RNAiso Plus、Taq酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自立陶宛Fermentas公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司(型號(hào)：Forma3110)，光學(xué)顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯(中國(guó))有限公司(型號(hào)：BX51)，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司(型號(hào)：Bio-Rad ChemiDoc MP)。

1.3 研究方法

1.3.1 標(biāo)本采集

胎盤娩出后10 min內(nèi)取材，即從近臍帶附著處切取胎盤全層組織2塊，每塊組織大小為1 cm×1 cm×0.2 cm。用預(yù)冷的滅菌0.9%氯化鈉注射液快速?zèng)_洗3次，去除血污，其中1塊組織用滅菌濾紙吸去水分，裝入1.5 mL的EP管中，放置-80 ℃ 冰箱保存；另1塊組織放入10%中性甲醛中固定24 h，經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明浸蠟后，石蠟包埋成塊，備用。

1.3.2 SqRT-PCR法檢測(cè)胎盤組織中Galectin-1 mRNA的表達(dá)水平

將超低溫凍結(jié)的胎盤組織標(biāo)本稱取50 mg，迅速置于用液氮預(yù)冷過(guò)的研缽中，在液氮中反復(fù)研磨至粉末，加入RNAiso Plus進(jìn)行組織總RNA提取。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。建立PCR反應(yīng)體系：Template DNA 1 μL，F(xiàn)orward primer(10 mmol·L-1)1 μL，Reverse primer(10 mmol·L-1)1 μL，PCR Master Mix(2×)10 μL，nuclease-free water 7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性1 min，60 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。PCR引物(PCR引物由上海英駿生物有限公司合成)：Galectin-1[5′-CTGAACCTGGGCAAAGACAG-3′(上游引物)，5′-GCGGTTGGGGAACTTGAATT-3′(下游引物)]、β-actin[5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′(上游引物)，5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′(下游引物)]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，GelRed染色，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。以Galectin-1/β-actin比值代表Galectin-1 mRNA的表達(dá)水平。

1.3.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)胎盤組織中Galectin-1的表達(dá)

將石蠟包埋成塊的胎盤組織3 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化并進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加3% H2O2室溫孵育10 min，再加入山羊抗人Galectin-1多克隆抗體(1:250稀釋)和小鼠抗人CD34單克隆抗體(即用型)，4 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜。PBS漂洗10 min，加入HRP標(biāo)記二抗，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，DAB顯色，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，常規(guī)脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判讀由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行閱片。按文獻(xiàn)[8]的評(píng)分方法，再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比(無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～80%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>80%為4分)和染色強(qiáng)弱(無(wú)為0分，弱為1分，中為2分，強(qiáng)為3分)的乘積進(jìn)行免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS)，按照評(píng)分的分值判斷為陰性(0～3分)，陽(yáng)性(弱+中+強(qiáng)，4～12分)。

1.3.4 胎盤組織中微血管密度的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[9]的方法，進(jìn)行微血管密度計(jì)數(shù)：以CD34抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行閱片，在光學(xué)顯微鏡(40倍)下選取微血管密度最高的區(qū)域，然后在光學(xué)顯微鏡(400倍)下觀察5個(gè)不重復(fù)的視野，單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞著色亦作為1個(gè)計(jì)數(shù)單位，但直徑>100 μm的血管予以剔除。計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)微血管的數(shù)目，取平均數(shù)作為微血管密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達(dá)水平：正常對(duì)照組為0.131±0.029，輕度組為0.381±0.039，重度組為0.662±0.045。輕度組、重度組胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組，重度組胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達(dá)水平明顯高于輕度組，均P<0.05。見圖1—2。

輕度組、重度組胎盤組織中Galectin-1陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于正常對(duì)照組，重度組胎盤組織中Galectin-1陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于輕度組，均P<0.05。見表1。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Galectin-1主要表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞膜。見圖3封三。

表1 各組胎盤組織中Galectin-1表達(dá)率的比較

胎盤組織中微血管密度值：重度組為36.25±9.25，輕度組為52.13±6.35。重度組胎盤組織中微血管密度值明顯低于輕度組(P<0.05)。子癇前期胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達(dá)水平與微血管密度值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.416 3，P<0.05)。

3 討論

子癇前期是嚴(yán)重危害母嬰健康的產(chǎn)科并發(fā)癥，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究一直是產(chǎn)科領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前，有研究[10]認(rèn)為，子癇前期的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及母體、胎盤、胎兒等眾多因素的復(fù)雜病理過(guò)程。遺傳、免疫、環(huán)境等因素致滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)淺，子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不足，絨毛間質(zhì)微血管形成減少，進(jìn)而引起胎盤缺血、缺氧，其是子癇前期發(fā)病的始動(dòng)因素。胎盤缺血、缺氧加重細(xì)胞損傷，釋放多種胎盤因子進(jìn)入母體血液循環(huán)、促使炎癥免疫過(guò)度激活和血管內(nèi)皮損傷是子癇前期發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。Galectin-1屬于動(dòng)物凝集素家族成員，由LGALS1基因編碼，定位于22q13.1染色體[11]。Galectin-1廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，可與層粘連蛋白、整合素β1亞基、細(xì)胞外基質(zhì)等多種靶分子結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、黏附及炎癥免疫反應(yīng)等作用。隨著研究的深入，Galectin-1在參與調(diào)控腫瘤發(fā)生、血管生成、免疫耐受等過(guò)程中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注[12-13]。

目前，有研究[14]發(fā)現(xiàn)，Galectin-1除了在胸腺、腎臟以及結(jié)直腸癌等惡性腫瘤組織中有較強(qiáng)表達(dá)外，在分泌期子宮內(nèi)膜和蛻膜組織中也有一定豐度的表達(dá)。Tirado González等[15]采用ELISA法檢測(cè)早、中、晚3個(gè)不同妊娠階段共70例孕婦血清中Galectin-1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)自妊娠早期開始，孕婦外周血中Galectin-1表達(dá)水平升高，于妊娠中期到達(dá)最高峰，并維持這種高水平表達(dá)至妊娠晚期。進(jìn)一步研究證實(shí)，Galectin-1最早出現(xiàn)在卵裂期和囊胚期等胚胎發(fā)育階段并普遍表達(dá)于妊娠早期和晚期各型滋養(yǎng)細(xì)胞中。Freitag等[16]研究發(fā)現(xiàn)，外源性注入Galectin-1能夠改變小鼠胚胎在著床過(guò)程中因血管生成受阻，而導(dǎo)致發(fā)育停止。筆者通過(guò)SqRT-PCR法、免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Galectin-1在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，輕度組、重度組胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達(dá)水平、Galectin-1陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于正常對(duì)照組(均P<0.05)，子癇前期胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達(dá)水平與微血管密度值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.416 3，P<0.05)，提示Galectin-1可能通過(guò)調(diào)控胎盤微血管生成參與子癇前期的病理過(guò)程。

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