格爾德霉素和環(huán)孢素聯(lián)合常用抗真菌藥對(duì)阿薩希毛孢子菌臨床株體外藥敏研究

廖 勇，楊蘇騰，叢 林，彭卓穎，郎德休，敖俊紅，楊蓉婭

毛孢子菌既可正常定植于人體的皮膚、黏膜，同時(shí)也可以引起季節(jié)性過敏性肺炎、淺部和深部感染[1]，毛孢子菌引起深部感染的病死率可高達(dá)77%[2]。侵襲性毛孢子菌病是一種少見、但致死性強(qiáng)的真菌感染性疾病，主要累及免疫功能缺陷的宿主。侵襲性毛孢子菌病最常見的感染類型是毛孢子菌菌血癥，其中阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii）為最常見的病原菌[2]。研究發(fā)現(xiàn)，1975年—2014年毛孢子菌菌血癥全球的報(bào)道數(shù)量逐漸增加，但患者的病死率未見明顯改善[2]；而且，毛孢子菌屬具有特定的耐藥模式，其對(duì)棘白菌素類抗真菌藥先天耐藥，對(duì)于兩性霉素B敏感性不高[1]。最新的指南和一些回顧性研究推薦系統(tǒng)使用三唑類抗真菌藥治療侵襲性毛孢子菌病[3]，特別是伏立康唑具有良好的體外和體內(nèi)抗毛孢子菌活性。三唑類抗真菌藥屬于抑菌藥，長(zhǎng)期臨床應(yīng)用可能出現(xiàn)臨床耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。體外實(shí)驗(yàn)證明，長(zhǎng)時(shí)間暴露于氟康唑可獲得高最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值的阿薩希毛孢子菌耐藥株[4]。近年來(lái)已經(jīng)有阿薩希毛孢子菌的氟康唑高M(jìn)IC值臨床株的報(bào)道[5]，甚至有阿薩希毛孢子菌多藥耐藥株的臨床報(bào)道[6]。因此，需要探索針對(duì)侵襲性毛孢子菌病新的抗真菌治療策略。

熱休克蛋白90（heat shock protein，Hsp90）是真核細(xì)胞的信號(hào)通路和應(yīng)激反應(yīng)中重要的調(diào)控分子，研究發(fā)現(xiàn)其在病原真菌對(duì)三唑類抗真菌藥耐藥中發(fā)揮重要作用，且主要是通過鈣調(diào)磷酸酶通路[7]。既往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hsp90抑制劑和環(huán)孢素單獨(dú)使用或聯(lián)合常用抗真菌藥對(duì)念珠菌和釀酒酵母均具有體外抑制作用[8,9]。Cowen和Lindquist[9]研究顯示抑制釀酒酵母Hsp90的功能可以阻斷其對(duì)唑類抗真菌藥快速誘導(dǎo)耐藥的發(fā)生。 Kubica 等[10]最新的研究發(fā)現(xiàn)他克莫司（鈣調(diào)磷酸酶抑制劑）可增強(qiáng)兩性霉素B和卡泊芬凈對(duì)阿薩希毛孢子菌的體外抗真菌活性。Hsp90抑制劑和其他鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素）對(duì)阿薩希毛孢子菌的體外活性仍不清楚。本研究檢測(cè)了Hsp90抑制劑（格爾德霉素）和環(huán)孢素單獨(dú)和聯(lián)合5種常用抗真菌藥（氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B和卡泊芬凈），對(duì)阿薩希毛孢子菌的體外抗真菌活性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和藥物

環(huán)孢素、格爾德霉素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B和卡泊芬凈均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。ATCC 22019及CBS 2479（阿薩希毛孢子菌臨床標(biāo)準(zhǔn)株）購(gòu)自荷蘭CBS真菌生物多樣性中心；20株阿薩希毛孢子菌臨床株（通過IGS1測(cè)序鑒定）均分離自毛孢子菌病患者，并保存于陸軍總醫(yī)院皮膚損傷修復(fù)研究所真菌實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 的標(biāo)準(zhǔn)M27-A3肉湯稀釋法，使用96孔板(Costar)檢測(cè)上述菌株對(duì)格爾德霉素、環(huán)孢素以及抗真菌藥的體外抗真菌活性（MIC值）。35℃下孵育48 h后讀取結(jié)果。三唑類抗真菌藥物、環(huán)孢素、格爾德霉素和卡泊芬凈MIC值的讀取標(biāo)準(zhǔn)為：與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比，真菌生長(zhǎng)≤50%的最低藥物濃度；兩性霉素B的MIC值讀取標(biāo)準(zhǔn)為：與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比，真菌生長(zhǎng)完全被抑制的最低藥物濃度。棋盤微量液基稀釋法檢測(cè)上述2種抑制劑與常用抗真菌藥的相互作用，聯(lián)合用藥時(shí)MIC值的讀取標(biāo)準(zhǔn)均為：與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比，真菌生長(zhǎng)≤50%的最低藥物濃度?；诜旨?jí)抑制濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）模型分析藥物相互作用，F(xiàn)ICI值=（聯(lián)合作用時(shí)A藥MIC值/單藥時(shí)A藥MIC值）+（聯(lián)合作用時(shí)B藥MIC值/單藥時(shí)B藥MIC）；FICI≤0.5 時(shí)，兩藥的相互作用判定為協(xié)同作用；0.5＜FICI≤4 時(shí)判定兩藥為無(wú)關(guān)作用；當(dāng) FICI＞4 時(shí)兩藥為拮抗作用。格爾德霉素、環(huán)孢素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬凈和兩性霉素B在本研究中所使用的藥物濃度范圍分別是：0.03～32.00 μg/ml、0.0125 ～ 200.0000 μg/ml、0.03 ～ 32.00 μg/ml、0.0075 ～ 8.0000 μg/ml、0.001 ～ 1.000 μg/ml、0.06 ～ 64.00μg/ml和 0.0075 ～ 8.0000 μg/ml。

2 結(jié)果

所有檢測(cè)的阿薩希毛孢子菌菌株對(duì)臨床常用抗真菌藥的MIC值范圍分別為：兩性霉素B 0.25～4.0 μg/ml、 氟 康 唑 1.0 ～ 16.0 μg/ml、 伊 曲 康 唑0.25 ～ 1.00 μg/ml、伏立 康唑 0.03 ～ 0.25 μg/ml和卡泊芬凈8～64 μg/ml （表1）。格爾德霉素對(duì)阿薩希毛孢子菌臨床株具有一定的抗真菌作用，其MIC值范圍為8～32 μg/ml，但環(huán)孢素未顯示出對(duì)其明顯的抗真菌作用，其MIC值范圍為：所有臨床株均200 μg/ml以上（表1）。對(duì)21株臨床株的聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)顯示多數(shù)具有一定的協(xié)同作用。兩性霉素B聯(lián)合格爾德霉素和兩性霉素B聯(lián)合環(huán)孢素顯示出最好的協(xié)同作用，基于FICI模型，所有菌株均顯示出協(xié)同作用（100%）；聯(lián)合使用時(shí)，兩性霉素B的MIC值分別降低了4～32倍和4～16倍，同時(shí)FICI的范圍分別是0.092～0.5和0.062～0.258（表2）。同時(shí)，格爾德霉素與伊曲康唑和伏立康唑的聯(lián)合也表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用。基于FICI模型，多數(shù)菌株均顯示出協(xié)同作用（均為90.48%）；聯(lián)合使用時(shí)，伊曲康唑的MIC值從0.25～1.0 μg/ml降低到0.03～0.25 μg/ml，伏立康唑的MIC值從0.03～0.25 μg/ml降低到0.002～0.03 μg/ml（表2）。對(duì)于21株阿薩希毛孢子菌臨床株，所有藥物聯(lián)合均未發(fā)現(xiàn)拮抗作用。

表1 格爾德霉素、環(huán)孢素和抗真菌藥物對(duì)21株T. asahii的藥物敏感性

表2 格爾德霉素及環(huán)孢素聯(lián)合常用抗真菌藥物對(duì)21株T. asahii的相互作用關(guān)系

3 討論

近年來(lái)出現(xiàn)了阿薩希毛孢子菌臨床耐藥的報(bào)道，甚至還有多藥耐藥株的報(bào)道[11]。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在藥物應(yīng)激誘導(dǎo)壓力下，阿薩希毛孢子菌可出現(xiàn)適應(yīng)性耐藥的表型[4]。由于侵襲性毛孢子菌病病死率高，但臨床治療選擇少，目前指南中僅推薦三唑類抗真菌藥用于侵襲性毛孢子菌病的系統(tǒng)治療，所以需要嘗試并探討更多的臨床治療策略來(lái)提高治愈率，減少耐藥菌株的出現(xiàn)。Hsp90是真核細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其功能與病原真菌的毒力和耐藥密切相關(guān)，其不同的客戶蛋白參與不同的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答，鈣調(diào)磷酸酶是白念珠菌中最早被鑒定出的客戶蛋白[7]。本研究通過體外藥敏實(shí)驗(yàn)的方法初步探討上述通路與阿薩希毛孢子菌耐藥表型的關(guān)系。

既往研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母和白念珠菌的Hsp90可以穩(wěn)定其鈣調(diào)磷酸酶的催化亞基，敲除Hsp90基因會(huì)引起鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致鈣調(diào)磷酸酶功能的缺失，從而阻斷藥物應(yīng)激后鈣調(diào)磷酸酶依賴的細(xì)胞存活相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)[12]。Cown和Lindquist[9]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制Hsp90的功能可以阻斷藥物誘導(dǎo)釀酒酵母所產(chǎn)生的快速適應(yīng)性耐藥，從而進(jìn)一步阻斷誘導(dǎo)耐藥子代獲得較穩(wěn)定的唑類耐藥表型。本研究發(fā)現(xiàn)，單藥應(yīng)用格爾德霉素可明顯抑制所有阿薩希毛孢子菌臨床株，其MIC范圍是4～32 μg /ml，這與既往對(duì)于念珠菌屬臨床株的體外藥敏結(jié)果一致（MIC 3.2～ 12.8 μg/ml）[8]，但曲霉則表現(xiàn)出對(duì)其不敏感（MIC＞16 μg/ml）[13]。所有菌株對(duì)于環(huán)孢素的MIC值均＞200 μg/ml，這與上游阻斷劑（格爾德霉素）的結(jié)果不一致，可能是由于Hsp90存在多種客戶蛋白，環(huán)孢素阻斷的鈣調(diào)磷酸酶通路應(yīng)答反應(yīng)可能被其他客戶蛋白有所代償[14,15]。

既往體外藥敏的研究發(fā)現(xiàn)，格爾德霉素或環(huán)孢素聯(lián)合常用抗真菌藥后，念珠菌屬、曲霉屬和隱球菌屬的臨床分離株對(duì)常用抗真菌藥的MIC值均有不同程度的下降，藥物之間顯示出不同程度的協(xié)同效應(yīng)[16-19]。而且對(duì)氟康唑耐藥白念珠菌臨床株的體外藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，格爾德霉素和環(huán)孢素可顯著降低氟康唑耐藥白念珠菌臨床株的MIC值（降低16倍以上）[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于21株阿薩希毛孢子菌臨床株（1株外購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)株和20株本實(shí)驗(yàn)室保存），格爾德霉素和環(huán)孢素均顯示出與4種常用抗真菌藥不同比例的協(xié)同效應(yīng)（10種聯(lián)合的協(xié)同率范圍為33.33%～95.23 %）。雖然阿薩細(xì)毛孢子對(duì)于棘白菌素類抗真菌藥先天耐藥，且對(duì)于兩性霉素B的敏感性不高，但一項(xiàng)巴西的研究發(fā)現(xiàn)，通過聯(lián)合他克莫司可顯著降低體外藥敏實(shí)驗(yàn)中阿薩希毛孢子菌臨床株對(duì)兩性霉素B和卡泊芬凈的MIC值[10]。本研究也得到了類似的結(jié)果，兩性霉素B與格爾德霉素或環(huán)孢素的聯(lián)合對(duì)于所有臨床株（21株）均顯示出協(xié)同作用（100%）。

一項(xiàng)對(duì)于大蠟螟白念珠菌感染模型的研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)給予Hsp90抑制劑（烯丙基氨基格爾德霉素）可以顯著提高氟康唑的治療效果，與單獨(dú)使用氟康唑組相比，白念珠菌感染大蠟螟的存活率可提高90%以上[20]。另一項(xiàng)對(duì)于大蠟螟煙曲霉感染模型的研究也獲得了類似的結(jié)果：與單獨(dú)應(yīng)用棘白菌素類抗真菌藥組相比，聯(lián)合Hsp90抑制劑可提高煙曲霉感染大蠟螟的存活率[21]。系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型系統(tǒng)治療濃度的氟康唑，如果同時(shí)抑制白念珠菌Hsp90基因的表達(dá)，與非治療陽(yáng)性對(duì)照組相比，感染小鼠腎臟的菌體負(fù)荷下降72.2%，而白念珠菌Hsp90基因未干預(yù)組感染小鼠腎臟的菌體負(fù)荷僅下降28.6%，說(shuō)明白念珠菌Hsp90的表達(dá)有助于其在宿主體內(nèi)時(shí)應(yīng)對(duì)藥物應(yīng)激壓力[20]。上述體內(nèi)及體外研究結(jié)果提示Hsp90-鈣調(diào)磷酸酯酶通路可能在病原真菌耐藥中發(fā)揮重要作用，本研究的結(jié)果特別提示：在阿薩希毛孢子菌對(duì)兩性霉素B的耐藥中，Hsp90和鈣調(diào)磷酸酶可能發(fā)揮了核心作用。

最新的治療指南和我們既往的系統(tǒng)性回顧均推薦使用三唑類抗真菌藥，特別是伏立康唑作為侵襲性毛孢子菌病治療的首選用藥，而其對(duì)兩性霉素B治療的反應(yīng)不佳[2,3]，但研究發(fā)現(xiàn)兩性霉素B聯(lián)合氟康唑也可以達(dá)到良好的治療效果[2]?；诒狙芯康慕Y(jié)果，聯(lián)合使用格爾德霉素或環(huán)孢素可以提高阿薩希毛孢子菌對(duì)于兩性霉素B的敏感性；特別要強(qiáng)調(diào)本研究中聯(lián)合用藥所獲得的環(huán)孢素 MIC值，多數(shù)在人體的安全血藥濃度范圍內(nèi)（＜0.6 μg/ml）。環(huán)孢素是血液系統(tǒng)腫瘤治療方案中的常用藥，而血液系統(tǒng)腫瘤則是侵襲性毛孢子菌病最常見的基礎(chǔ)疾病[2]，這可能為臨床提供了另一個(gè)基于患者具體病情制定聯(lián)合用藥方案的策略。此外，三唑類抗真菌藥的長(zhǎng)期臨床應(yīng)用會(huì)引起耐藥的出現(xiàn)[4]，Hsp90-鈣調(diào)磷酸酶通路抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用在提高抗真菌藥效果的同時(shí)，可能減少長(zhǎng)期應(yīng)用三唑類抗真菌藥出現(xiàn)獲得性耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究的結(jié)果證明Hsp90-鈣調(diào)磷酸酶通路的抑制劑可以提高阿薩希毛孢子菌對(duì)常用抗真菌藥的敏感性；但仍需要更多的體內(nèi)和相關(guān)機(jī)制研究為未來(lái)的臨床應(yīng)用提供更多證據(jù)支撐。

【參 考 文 獻(xiàn)】

[1]Colombo AL, Padovan AC, Chaves GM. Current knowledge ofTrichosporon spp.and Trichosporonosis [J]. Clin Microbiol Rev,2011, 24(4):682-700.

[2]Liao Y, Lu X, Yang S, et al. Epidemiology and outcome of Trichosporon Fungemia: A review of 185 reported cases from 1975 to 2014 [J]. Open Forum Infect Dis, 2015, 2(4):ofv141.

[3]Arendrup MC, Boekhout T, Akova M, et al. ESCMID and ECMM joint clinical guidelines for thediagnosis and management of rare invasive yeast infections [J]. Clin Microbiol Infect, 2014, 20(Suppl 3):76-98.

[4]Kushima H, Tokimatsu I, Ishii H, et al. Cloning of the lanosterol 14-alpha-demethylase ( ERG11 )gene inTrichosporon asahii:a possible association between G453R amino acid substitution andazole resistance inT.asahii[J]. FEMS Yeast Res, 2012, 12(6):662-667.

[5]Wolf DG, Falk R, Hacham M, et al. Multidrug-resistantTrichosporon asahiiinfection of nongranulocytopenic patients in three intensive care units [J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(12):4420-4425.

[6]Basu S, Tilak R, Kumar A. Multidrug-resistant Trichosporon: an unusual fungal sepsis in preterm neonates [J]. Pathog Glob Health,2015, 109(4):202-206.

[7]Cowen LE, Steinbach WJ. Stress, drugs, and evolution: the role of cellular signaling in fungal drugresistance [J]. Eukaryot Cell, 2008, 7(5):747-764.

[8]Zhang J, Liu W, Tan J, et al. Antifungal activity of geldanamycin alone or in combination withfluconazole against Candida species [J].Mycopathologia, 2013, 175(3-4):273-279.

[9]Cowen LE, Lindquist S. Hsp90 potentiates the rapid evolution of new traits: drug resistance indiverse fungi [J]. Science, 2005, 309(5744):2185-2189.

[10]Kubica TF, Denardi LB, Azevedo MI, et al. Antifungal activities of tacrolimus in combination with antifungal agents against fluconazolesusceptible and fluconazole-resistantTrichosporon asahiiisolates [J].Braz J Infect Dis, 2016, 20(6):539-545

[11]Oliveira dos Santos C, Zijlstra JG, Porte RJ, et al. Emerging panresistance in Trichosporon species: a case report [J]. BMC Infect Dis,2016, 16(1):148.

[12]Singh SD, Robbins N, Zaas AK, et al. Hsp90 governs echinocandin resistance in the pathogenic yeast Candida albicans via calcineurin [J].PLoS Pathog, 2009, 5(7):e1000532.

[13]Lamoth F, Alexander BD, Juvvadi PR, et al. Antifungal activity of compounds targeting the Hsp90-calcineurin pathway against various mould species [J]. J Antimicrob Chemother, 2015, 70(5):1408-1411.

[14]Jain P, Akula I, Edlind T. Cyclic AMP signaling pathway modulates susceptibility of candidaspecies andSaccharomyces cerevisiaeto antifungal azoles and other sterol biosynthesisinhibitors [J].Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(10):3195-3201.

[15]Borah S, Shivarathri R, Kaur R. The Rho1 GTPase-activating protein CgBem2 is required for survival of azole stress inCandida glabrata[J]. J Biol Chem, 2011, 286(39):34311-3424.

[16]Sanglard D, Ischer F, Marchetti O, et al. Calcineurin A ofCandida albicans: involvement in antifungal tolerance, cell morphogenesis and virulence [J]. Mol Microbiol 2003, 48(4):959-976.

[17]Chen YL, Lehman VN, Lewit Y, et al. Calcineurin governs thermotolerance and virulence ofCryptococcus gattii[J]. G3(Bethesda), 2013,3(3):527-539.

[18]Chen YL, Brand A, Morrison EL, et al. Calcineurin controls drug tolerance, hyphal growth, and virulence in Candida dubliniensis [J].Eukaryot Cell, 2011, 10(6):803-819.

[19]Singh-Babak SD, Babak T, Diezmann S, et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance inCandida glabrata[J]. PLoS Pathog, 2012, 8(5):e1002718.

[20]Cowen LE, Singh SD, Kohler JR, et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease [J]. Proc Natl Acad Sci, 2009, 106(8):2818-2823.[21]Cowen LE. Hsp90 orchestrates stress response signaling governing fungal drug resistance [J]. PLoS Pathog, 2009, 5(8):e1000471.