冀玉良，王依依

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

土壤是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中主要的構(gòu)成要素之一，也是陸生生態(tài)系統(tǒng)的重要基礎(chǔ)，而土壤中的微生物又是土壤的重要生物因子[1-2]。土壤的微生物功能就是土壤生物群總生理活性的反映，通常用土壤呼吸作用強(qiáng)度來(lái)表示，即一定土壤表面在一定時(shí)間內(nèi)所放出的CO2量，它由土壤微生物在生命活動(dòng)中所吸收的氧和釋放的CO2，以及它們?cè)谕寥乐械臄U(kuò)散速度所決定。土壤呼吸能力不僅對(duì)土壤有機(jī)物的分解至關(guān)重要,而且呼吸釋放的CO2也是植物同化作用CO2的重要來(lái)源。因此，土壤呼吸強(qiáng)度是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)之一，與植物生長(zhǎng)有著密切的關(guān)系[3-4]。中藥材種植中面臨的主要問(wèn)題是病蟲(chóng)害的連作障礙，盡管病蟲(chóng)害的生物防治研究取得了很大進(jìn)展，一些研究成果已得以推廣應(yīng)用[5-6]，但目前中藥材生產(chǎn)中病蟲(chóng)害防治主要依靠的還是農(nóng)藥[7-9]。當(dāng)農(nóng)藥分解緩慢而又頻繁使用時(shí),相當(dāng)量的農(nóng)藥就會(huì)在一定時(shí)期內(nèi)殘留于土壤之中，對(duì)土壤微生物功能產(chǎn)生不良的影響[10-11]。甲基硫菌靈（商品名甲基托布津）、多菌靈和農(nóng)用鏈霉素是目前商洛中藥材種植中防治病蟲(chóng)害普遍采用的3種農(nóng)藥，但有關(guān)3種農(nóng)藥對(duì)中藥材生長(zhǎng)土壤呼吸功能的抑制的研究目前尚末見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)本試驗(yàn)研究，旨在揭示3種農(nóng)藥及其4種濃度對(duì)桔梗種植土壤微生物呼吸功能的抑制規(guī)律，尋找最佳的農(nóng)藥和合適的用藥劑量，為使用農(nóng)藥防治桔梗等中藥材病蟲(chóng)害提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 供試農(nóng)藥

選擇目前商洛市中藥材生產(chǎn)的病蟲(chóng)害防治普遍使用的3種農(nóng)藥甲基硫菌靈、多菌靈和鏈霉素，從市場(chǎng)購(gòu)得，3種農(nóng)藥分別按說(shuō)明含量配成100、1000、10000、100000 mg·L－1的溶液。

1.2 供試土壤

土樣來(lái)自商洛天士力藥業(yè)集團(tuán)的桔梗種植基地0～l5 cm深的耕作層土壤，采取五點(diǎn)采樣法，除去土塊等雜物，將五處土壤混在一起裝入無(wú)菌自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，平攤在聚乙烯塑料布上，風(fēng)干過(guò)40目篩，備用。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于室內(nèi)模擬旱地條件進(jìn)行，對(duì)土壤微生物呼吸強(qiáng)度的測(cè)定采取密閉直接吸收法，即將供試土壤置于密閉的玻璃瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)放置NaOH溶液直接吸收微生物呼吸中所釋放出的CO2，再用準(zhǔn)確標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)HCl滴定溶液中剩余的NaOH量，并由此計(jì)算出供試土壤微生物的呼吸能力。具體操作如圖1所示。

圖1 直接吸收法測(cè)定土壤吸收功能的培養(yǎng)瓶

分別稱取風(fēng)干過(guò)篩的土樣30 g，置于小燒杯中，往土樣中加適量的無(wú)菌水（包括藥液容量在內(nèi)）濕潤(rùn)，充分混勻，使其濕度接近旱地自然條件狀態(tài)，然后將盛土壤燒杯移至容量為1000 mL的廣口玻璃瓶?jī)?nèi)（具蓋能密閉），為維持瓶?jī)?nèi)濕度在瓶底倒入少量酸性水（按H2SO4：水=2:1的體積比）。將玻璃瓶移至25℃～28℃保溫箱內(nèi)先預(yù)培養(yǎng)，一周后取出盛土壤的燒杯，對(duì)土樣按4個(gè)濃度梯度處理，分別混入 100、1000、10000、100000 mg·L－1的每種藥液3 mL，使3種農(nóng)藥各處理按干土重計(jì)算含藥量分別為 10、100、1000、10000 mg·kg－1，同時(shí)以加3 mL蒸餾水代替農(nóng)藥作為對(duì)照，各處理充分混勻后放回培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。另取50 mL小燒杯（內(nèi)盛經(jīng)標(biāo)定的NaOH溶液10 mL）置于培養(yǎng)瓶中，用以吸收由土壤微生物呼吸作用所釋放出的CO2。玻璃瓶加蓋后移至保溫箱內(nèi)再培養(yǎng)，按期取出裝有NaOH溶液的小燒杯并立即用準(zhǔn)確標(biāo)定的0.1 mol·L－1HCl滴定燒杯中剩余的NaOH。 接著在玻璃瓶?jī)?nèi)再換入盛有新的NaOH溶液的小燒杯，繼續(xù)按期培養(yǎng)，如此按期換液、培養(yǎng)和測(cè)定（1、3、5、7、9、14、19、24、29、34、40、46、52、58、64 d），不同處理的土壤微生物呼吸作用強(qiáng)度用100 g土壤的CO2表示，CO2計(jì)算公式為：

100 g土壤的CO2=（空白值—滴定值）×C×CO2摩爾質(zhì)量×100／土樣質(zhì)量（g）

式中：C 為標(biāo)準(zhǔn) HCl濃度（mol·L－1），空白值為未吸收CO2的全部NaOH的標(biāo)準(zhǔn)HCl滴定值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft excel 2016統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

圖2、圖3和圖4是根據(jù)不同劑量的甲基硫菌靈、多菌靈和鏈霉素對(duì)土壤進(jìn)行處理后每一時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的CO2的曲線,圖中顯示了3種農(nóng)藥不同劑量處理對(duì)土壤呼吸影響的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

圖2 甲基硫菌靈不同劑量對(duì)土壤呼吸作用的影響

不同劑量的甲基硫菌靈處理土壤（見(jiàn)圖2），施藥后的第1天，測(cè)得的CO2基本上接近對(duì)照,但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)（從第3～46天），不同劑量的甲基硫菌靈處理土壤產(chǎn)生的CO2明顯低于對(duì)照，表明施藥對(duì)微生物的呼吸功能產(chǎn)生了明顯的抑制，至第46天后，各處理與對(duì)照開(kāi)始逐步接近，說(shuō)明農(nóng)藥對(duì)微生物的呼吸抑制逐漸降低。就不同處理的比較來(lái)看，呈現(xiàn)出高劑量的處理產(chǎn)生的CO2低于低劑量處理，如10 mg·kg－1劑量處理產(chǎn)生的CO2與對(duì)照很接近，至第5天和第7天的測(cè)定結(jié)果顯示產(chǎn)生的CO2還高于對(duì)照，這說(shuō)明低劑量、短時(shí)間的施藥還能刺激和促進(jìn)呼吸功能，但隨后則呈現(xiàn)出抑制作用。而 100、1000 mg·kg－1處理產(chǎn)生的CO2明顯降低，與對(duì)照相比達(dá)到P＜0.05的差異顯著性水平,10000 mg·kg－1劑量處理與對(duì)照相比達(dá)到P＜0.01的差異顯著性水平，即對(duì)土壤的呼吸功能產(chǎn)生顯著的影響。至第46天以后，各個(gè)處理與對(duì)照的差異變小，推測(cè)可能是微生物對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性，或者是農(nóng)藥被微生物慢慢轉(zhuǎn)化和分解的緣故。

殺菌劑多菌靈對(duì)土壤微生物呼吸影響表現(xiàn)出和甲基硫菌靈基本相似的規(guī)律（見(jiàn)圖3），但在開(kāi)始一段時(shí)間（1～24 d）低劑量和高劑量處理下產(chǎn)生的CO2與對(duì)照（CK）的差異均比甲基硫菌靈處理大，說(shuō)明抑制作用明顯，10 mg·kg－1劑量處理 P＜0.05，在 100、1000、l0000 mg·kg－1劑量處理下均達(dá)到P＜0.01的顯著性水平。而且與甲基硫菌靈不同的是，多菌靈的各個(gè)處理在施藥后短期 (7 d內(nèi))呼吸作用降低的幅度更為明顯，如l0000 mg·kg－1多菌靈處理在第 3 天、 第 5 天、第7天產(chǎn)生的CO2分別是同一時(shí)期對(duì)照的70.67%、63.49%和 46.88%, 而 l0000 mg·kg－1甲基硫菌靈處理在第3天、第5天和第7天產(chǎn)生的CO2分別是同一時(shí)期對(duì)照的94.7%、85.7%和65.6%。另外多菌靈在施藥第7天以后，各個(gè)處理與對(duì)照的差異開(kāi)始變小，表現(xiàn)出比甲基硫菌靈較早向?qū)φ战咏?，這說(shuō)明相對(duì)甲基硫菌靈，多菌靈降低呼吸作用快，幅度也大，但抑制作用持續(xù)時(shí)間短，土壤呼吸功能恢復(fù)較快，推測(cè)這可能是土壤微生物對(duì)多菌靈更容易適應(yīng)，或者是多菌靈更容易被土壤微生物轉(zhuǎn)化和分解的緣故。

圖3 多菌靈不同劑量對(duì)土壤呼吸作用的影響

圖4 鏈霉素不同劑量對(duì)土壤呼吸作用的影響

鏈霉素與甲基硫菌靈、多菌靈也表現(xiàn)出相似的規(guī)律（見(jiàn)圖4），無(wú)論是高劑量或低劑量的處理，多次測(cè)得的結(jié)果也均低于對(duì)照，但從總體上來(lái)說(shuō)動(dòng)態(tài)曲線比較平緩，顯示出降低呼吸作用的幅度比前兩種農(nóng)藥小，各劑量處理整個(gè)變化過(guò)程中基本上與對(duì)照保持同樣的趨勢(shì)。其中低劑量處理與對(duì)照相比不明顯，只是10000 mg·kg－1劑量處理與對(duì)照的差異顯著（P＜0.05），對(duì)土壤呼吸具有較大的抑制作用。另外在低劑量處理第5天也表現(xiàn)出對(duì)土壤呼吸功能有促進(jìn)作用。

圖5 不同農(nóng)藥各處理培養(yǎng)期間釋放的CO2累計(jì)總量比較

從3種農(nóng)藥各處理組培養(yǎng)期間累計(jì)釋放的CO2總量統(tǒng)計(jì)來(lái)看（見(jiàn)圖 5）,與圖 2、圖 3、圖 4 也較為一致。從圖5中可以看出，在甲基硫菌靈和鏈霉素低劑量 10 mg·kg－1處理下產(chǎn)生的CO2總量與對(duì)照無(wú)明顯差異，多菌靈與對(duì)照在P＜0.05水平上有明顯差異（對(duì)照為660 mg/100 g干土，甲基硫菌靈、鏈霉素和多菌靈分別為632、631、604 mg/100 g干土）， 多菌靈在低劑量處理下產(chǎn)生的CO2總量與對(duì)照的差異與它在處理初期對(duì)呼吸作用抑制就比較大以及與整個(gè)過(guò)程與對(duì)照相差比較明顯相吻合。從CO2總量還反映出3種農(nóng)藥各個(gè)高劑量處理組與對(duì)照均有明顯的差距，達(dá)到P＜0.01的顯著性水平。同時(shí)圖 5 中也反映出高劑量的 1000、10000 mg·kg－1兩個(gè)處理之間無(wú)明顯的差異。

3 討論與結(jié)論

本研究采用密閉直接吸收法，研究了3種農(nóng)藥甲基硫菌靈、多菌靈和農(nóng)用鏈霉素及其4種濃度對(duì)桔梗種植土壤微生物呼吸功能的影響。總體來(lái)看，在3種農(nóng)藥作用下，土壤的微生物呼吸功能都受到了抑制，農(nóng)藥對(duì)土壤微生物呼吸功能的影響與其劑量直接相關(guān)，高濃度農(nóng)藥處理對(duì)微生物呼吸功能的抑制水平和抑制期均明顯超過(guò)低濃度，低濃度農(nóng)藥對(duì)土壤微生物呼吸功能的影響不大，即使產(chǎn)生一定的抑制作用，在短期內(nèi)也可以較快恢復(fù)；高濃度處理對(duì)土壤微生物呼吸功能的影響較為明顯，且恢復(fù)緩慢。

施藥濃度越大土壤受到的抑制也越大，隨著施藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理與對(duì)照的差異逐漸減小。同時(shí)因農(nóng)藥及其劑量的不同抑制作用的表現(xiàn)不完全相同。其中甲基硫菌靈對(duì)土壤微生物的呼吸的抑制持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，施藥46 d后才開(kāi)始向?qū)φ栈謴?fù)。多菌靈對(duì)土壤微生物呼吸功能的抑制在施藥初期表現(xiàn)最為明顯，隨后抑制作用減輕，各劑量處理土壤的呼吸作用就逐漸向?qū)φ栈謴?fù)。鏈霉素的抑制作用相對(duì)較小，各處理土壤整個(gè)過(guò)程和對(duì)照基本保持同樣的變化趨勢(shì)。另外，在施藥的初期低劑量的甲基硫菌靈和鏈霉素都表現(xiàn)出對(duì)土壤呼吸功能有刺激和促進(jìn)作用，3種農(nóng)藥的高劑量處理和對(duì)照之間差異顯著，但各高劑量處理之間差異不顯著。

土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和關(guān)系極其復(fù)雜，農(nóng)藥對(duì)微生物呼吸功能的影響不僅與農(nóng)藥的毒性大小有關(guān)，也與微生物對(duì)農(nóng)藥的抗性和農(nóng)藥在土壤中是否容易被分解有關(guān)[10-12]。作用長(zhǎng)的農(nóng)藥可能是由于微生物對(duì)其抵抗力差或其較難分解而存留期長(zhǎng)的緣故，作用短的可能相反。本研究發(fā)現(xiàn)的多菌靈抑制作用初期明顯，第7天后減輕的結(jié)論，與徐瑞福[13]和向月琴[14]等的研究結(jié)果是一致的，同時(shí)也印證了甲基硫菌靈通常在分解中先要轉(zhuǎn)化為多菌靈而發(fā)揮作用，故甲基硫菌靈較多菌靈具有在土壤中作用時(shí)間長(zhǎng)的性質(zhì)[15-16]。

農(nóng)藥對(duì)土壤微生物呼吸功能的影響與其劑量直接相關(guān)，高濃度農(nóng)藥處理對(duì)微生物呼吸功能的抑制水平和抑制期均明顯超過(guò)低濃度，低濃度農(nóng)藥對(duì)土壤微生物呼吸功能的影響不大，即使產(chǎn)生一定的抑制作用，在短期內(nèi)也可以較快恢復(fù)；高濃度處理對(duì)土壤微生物呼吸功能的影響較為明顯，且恢復(fù)緩慢。

本研究發(fā)現(xiàn)的3種農(nóng)藥不同的抑制作用表現(xiàn)提示人們，在桔梗種植的病蟲(chóng)害防治中，不應(yīng)一味選擇高劑量的施藥濃度，同時(shí)在達(dá)到同樣防治效果的前提下，應(yīng)選擇對(duì)土壤抑制作用小，在土壤中存留時(shí)間短、易于分解的農(nóng)藥。根據(jù)本研究的結(jié)果，建議在桔梗病蟲(chóng)害防治中考慮到農(nóng)藥殘留問(wèn)題時(shí)選用多菌靈，因?yàn)槎嗑`雖然開(kāi)始大幅度地降低了呼吸作用，當(dāng)然對(duì)有益微生物和病源微生物都會(huì)降低，但在快速殺菌后，土壤呼吸功能在短期內(nèi)就能恢復(fù)。其次在殺菌效果相同的情況下選用農(nóng)用鏈霉素，因?yàn)檗r(nóng)用鏈霉素降低呼吸作用的幅度相對(duì)較小，對(duì)土壤肥力損失較少。如果在有些情況下甲基硫菌靈防治效果好，濃度也不宜太大。土壤微生態(tài)是一個(gè)很復(fù)雜的系統(tǒng)，關(guān)于農(nóng)藥使用后到底是對(duì)那一類微生物影響最大，以及農(nóng)藥怎樣影響土壤微生物類群結(jié)構(gòu)、土壤酶活性與土壤肥力，還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳曉明,王程龍,薄瑞,等.中國(guó)農(nóng)藥使用現(xiàn)狀及對(duì)策建議[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理,2016,37(2):4-8.

[2]魏中華,徐娟,郭明霞,等.國(guó)內(nèi)多菌靈的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(3):125-127,141.

[3]王秀國(guó),王一奇,嚴(yán)虎,等.多菌靈重復(fù)施藥對(duì)其持久性及土壤微生物群落功能多樣性的影響[J].土壤學(xué)報(bào),2010,47(1):131-137.

[4]黃永生,李曉軍,朱仕進(jìn),等.72%農(nóng)用鏈霉素防治魔芋軟腐病試驗(yàn)[J].長(zhǎng)江蔬菜,2012(20):78-79.

[5]冀玉良.根瘤菌對(duì)桔梗幼苗根際土壤微生物種群和酶活性的影響[J].商洛學(xué)院學(xué)報(bào),2015,29(6):49-54.

[6]冀玉良.植物根際促生菌的分離及對(duì)桔梗的促生效應(yīng)[J].商洛學(xué)院學(xué)報(bào),2017,31(6):42-46.

[7]滿潤(rùn),周永鋒,周艷琳,等.5種農(nóng)藥在溫室和露地番茄中消解動(dòng)態(tài)及安全使用研究[J].植物保護(hù),2017(21):123,125.

[8]葛躍武,袁紅銀,王學(xué)平.不同殺菌劑防治芋頭疫病田間藥效試驗(yàn)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2015(11):55-58.

[9]丁治軍,葛玉林,沈迎春,等.興化芋頭疫病安全用藥篩選試驗(yàn)初探[J].農(nóng)藥科學(xué)管理,2016,37(6):52-56.

[10]BOJACA C R,ARIAS L A,AHUMADA D A,et al.Evaluation of pesticide residues in open field and greeenhousetomatoes from Colombia[J].FoodControl,2013,30(2):400-403.

[11]周艷琳,周永鋒,陳恩祥,等.6種農(nóng)藥在溫室和露地辣椒上消解動(dòng)態(tài)及安全使用[J].中國(guó)蔬菜,2015(11):55-58.

[12]SPEDDING T A，HAMEL C，MEHUYS G R.Soil microbialdynamicsin maize growing soilunder different tillage and residuemanagement systems[J].Soil Biology and Biochemistry,2004(36):499-512.

[13]徐瑞福,將學(xué)杰,張玉泉,等.多菌靈對(duì)土壤微生物呼吸作用的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(8):66-68.

[14]向月琴,高春明,龐國(guó)輝,等.土壤中多菌靈的降解動(dòng)態(tài)及其對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響[J].土壤學(xué)報(bào),2008,45(4):699-704.

[15]尹顯慧,李榮玉,王梅,等.多菌靈和甲基硫菌靈在番茄和土壤中的殘留分析[J].農(nóng)藥,2014,53(3):191-193.

[16]張志勇,單煒力,簡(jiǎn)秋,等.甲基硫菌靈及其代謝物在不同種植模式黃瓜和土壤中的殘留[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2012,31(6):1077-1081.