梁旭華，任素娟，吳美妮

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

近年來，納米藥物輸送系統(tǒng)由于能夠?qū)⑺幬锇邢蜉斔椭敛≡畈课?，調(diào)節(jié)藥物釋放，有效提高藥物的生物利用度，降低毒副作用，因此引起了研究者的廣泛關(guān)注。據(jù)報道，粒徑為幾十到100 nm的納米粒子可以通過高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）富集于腫瘤部位[1-2]。因此，當(dāng)納米粒子載藥以后可以實現(xiàn)將藥物靶向輸送至腫瘤部位，增強腫瘤治療效果、降低毒副作用。介孔二氧化硅納米顆粒（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）是利用有機分子作為模板，形成的多孔納米材料[3]。MSNs不僅具有介孔材料的特性，而且也具有納米材料的特性，例如：均一的孔徑、規(guī)則的孔道、表面易被修飾、良好的生物相容性、比表面積大等特點，因此在生物醫(yī)藥、環(huán)境保護、傳感器、工業(yè)催化等方面有很大的應(yīng)用前景[4]。本研究以十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）為模板，正硅酸乙酯（TEOS）為硅源，采用水熱合成法、酸液萃取法制備介孔二氧化硅納米顆粒（MSNs），重點對其內(nèi)部孔道結(jié)構(gòu)、藥物載帶與釋放性能進行了研究，為介孔二氧化硅納米材料的進一步開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

姜黃素標(biāo)準品購自上海晶純生化科技股份有限公司，實驗用水為本實驗室自制，其他所有試劑均為分析純級別，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）為實驗現(xiàn)配。

實驗儀器：分析天平、pH計、磁力攪拌器、水熱反應(yīng)釜、電子恒溫水浴鍋、電子恒溫鼓風(fēng)干燥箱、超聲波清洗儀、高速離心機、真空干燥箱、傅里葉變換紅外光譜儀、Micromeritics ASAP 2020M型全自動比表面和孔隙分析儀、紫外分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 介孔二氧化硅納米載體（MSNs）的制備

1）稱取0.8 g十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶入到150 g去離子水中，隨后加入20 mL丙三醇（GL）和40 mL氨水溶液（25%），于50℃水浴鍋中攪拌0.5 h使其充分溶解，緩慢逐滴加入2 mL的正硅酸乙酯（TEOS）。該混合體系繼續(xù)在50℃下攪拌2 h，移至水熱反應(yīng)釜中于100℃烘箱中處理24 h，待自然冷卻后12000 r·min－1離心30 min，用乙醇和去離子水分別洗滌3次，最后于60℃真空干燥18 h備用。

2）稱取1.3 g上述樣品加入到120 mL無水乙醇和15 mL濃鹽酸中回流2 h，此操作方法重復(fù)兩次，然后 12000 r·min－1離心樣品 30 min，用大量無水乙醇和去離子水重復(fù)洗滌3次，最后于60℃干燥即可得到MSNs。

3）在其他試劑加入量及實驗條件不變的情況下，改變TEOS和氨水的用量，得到五組MSNs樣品，各組樣品所用TEOS和氨水的量，如表1所示。

表1 樣品中TEOS和NH3·H2O用量

1.2.2 載體的表征

采用ASAP 2020M型比表面及孔徑分析儀分析樣品的比表面積及孔道結(jié)構(gòu)特性；采用紅外光譜法測定樣品表面官能團；采用紫外-可見分光光度計測量藥物的吸收光譜。

1.2.3 姜黃素（Curcumin,Cur）載帶實驗

取0.5 g MSNs樣品加入一定量的去離子水，磁力攪拌使其分散，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中定容，得2 mg·mL－1的載體水分散液。各取20 mL于5個小燒杯中，分別滴加精密配制的不同濃度（1、2、3、4、5 mg·mL－1）的姜黃素乙醇溶液 1 mL，然后在常溫下磁力攪拌24 h達到平衡，離心分離，用95%的乙醇反復(fù)洗滌3次，收集上清液，沉淀于60℃干燥12 h，即可得到載帶Cur的樣品，記為Cur@MSNs。

1.2.4 載藥率(DLC)和包封率(EE)的測定

標(biāo)準曲線的繪制：精密稱量干燥的Cur 10 mg，通過無水乙醇溶解并置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度配制成儲備液。取5個10 mL容量瓶， 精密吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 儲備液，加無水乙醇定容至刻度，分別配制成1、2、3、4、5 μg·mL－1的 Cur標(biāo)準溶液， 利用紫外分光光度計于425 nm處測定吸光度。以吸光度對濃度進行線性回歸得到Cur的標(biāo)準曲線。如圖1所示，所得Cur的標(biāo)準曲線為：A=0.153C+0.0408（R2=0.9987，1≤C≤5）。

其中，A為Cur的吸光度值，C為Cur的濃度，μg·mL-1。

圖1 姜黃素的標(biāo)準曲線

利用紫外分光光度計在425 nm波長處測定Cur的吸光度，從而計算Cur的濃度和質(zhì)量。該載體的藥物載藥率和包封率計算公式為[5]：

1.2.5 藥物累積釋放量的測定

將所制備的Cur@MSNs分別超聲分散于pH=5.0和pH=7.4的PBS中37℃恒溫連續(xù)攪拌（100 r·min-1），每隔 20 min 取出 5 mL 溶液測定，并且及時補充等量釋藥介質(zhì)，將取出的樣品離心后采用紫外分光光度計測定吸光度，計算姜黃素的累計釋放量的計算公式為[6]：

其中：Q為藥物累積釋放量(%)；C為測定液中姜黃素的濃度(μg·mL－1)；V 為稀釋體積(mL)

2 結(jié)果與分析

2.1 粒度分析

本研究采用CTAB為模板劑，通過水熱合成法、酸液萃取法制備出不含模板劑的MSNs，表2為各組MSNs的相關(guān)參數(shù)。從表2可知：當(dāng)控制TEOS量不變的情況下，增加氨水的量，制備出的納米材料粒徑依次增大；當(dāng)控制氨水量不變的情況下，增加TEOS的量，制備出的納米材料粒徑明顯增大，與氨水相對比，所制備出的納米材料變化的幅度較大。由此可見，增加TEOS的加入量對MSNs粒度影響更為顯著。因此，通過改變TEOS和氨水的加入量可以更有效地控制MSNs的粒徑大小。

表2 MSNs樣品參數(shù)及粒徑

2.2 孔道結(jié)構(gòu)分析

眾所周知，納米材料的比表面積和孔隙結(jié)構(gòu)是影響藥物載帶能力的重要因素。本研究采用氮氣吸附—脫附法考察了所得納米載體的比表面積及孔道性質(zhì)，如圖2所示。從圖2可以看出，五個樣品的氮氣吸附—脫附曲線均表現(xiàn)出典型的IV吸附等溫線特征，并帶有一個典型的H1型遲滯環(huán)，說明所合成的MSNs載體均為介孔結(jié)構(gòu)。當(dāng)增加TEOS的用量而其他條件不變時，遲滯環(huán)發(fā)生了較小的變形，當(dāng)只增加氨水的量時，遲滯環(huán)發(fā)生了較嚴重的變形，其形狀變得更為扁平，并往低壓方向移動，說明此時N2的吸附量下降，MSNs的孔道結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[7]。同時由圖3可以看出，介孔二氧化硅納米顆粒具有較窄的孔徑分布，且孔徑約為10 nm，適合于藥物載帶。

圖2 MSNs的氮氣吸附-脫附曲線

圖3 MSNs的孔徑分布

2.3 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析

本研究進一步采用FT-IR光譜法分析了所得MSNs的表面功能基團，如圖4所示。1630 cm-1歸屬于H-O-H鍵的彎曲振動，1070 cm-1歸屬為Si-O-Si鍵的不對稱伸縮振動吸收峰，950 cm-1左右歸屬為Si-O鍵的伸縮振動峰，780 cm-1左右歸屬為Si-O-Si鍵的彎曲振動峰。這些特征峰的出現(xiàn)說明本研究成功制備得到介孔二氧化硅材料，與氮氣吸附—脫附曲線相吻合。

圖4 MSNs的紅外譜圖

2.4 紫外分光光度法測定載藥率和包封率

載藥率（DLC）和包封率（EE）是評價納米藥物載體優(yōu)劣的兩個重要指標(biāo)，本文以Cur為模型藥物研究了MSNs的藥物載帶與緩釋控釋性能。通過測定MSNs負載姜黃素前后乙醇溶液的濃度來確定溶液中姜Cur含量，由此計算Cur的載藥量，結(jié)果如表3和表4所示。結(jié)果表明：在Cur@MSNs載藥實驗中，當(dāng)控制納米材料粒徑不變的情況下，載藥量隨著Cur濃度的增大而增大，包封率相反；當(dāng)控制Cur濃度不變的情況下，納米材料的粒徑不斷增大，其載藥量也相應(yīng)增大。因此，Cur濃度和介孔二氧化硅納米材料粒徑的增大都可以增加其載藥量。

表3 各組MSNs樣品的載藥率

表4 各組MSNs樣品的包封率

2.5 MSNs的藥物釋放性能

研究表明，正常人體血液循環(huán)過程的pH值為7.4左右，而腫瘤組織由于細胞繁殖過快，氧氣供應(yīng)不足導(dǎo)致產(chǎn)生大量酸性代謝產(chǎn)物，大大降低了周圍微環(huán)境的pH值[8]。因此，可以利用腫瘤組織的該特征設(shè)計納米載藥系統(tǒng)，使其在酸性環(huán)境中快速釋放藥物而在生理pH條件下則釋放非常緩慢[9]。表5和表6給出了Cur@MSNs在pH為7.4和5.0時的體外藥物釋放數(shù)據(jù)。對比表5和表6可以看出Cur@MSNs具有優(yōu)良的藥物緩釋性能。當(dāng)pH=7.4時，姜黃素釋放非常緩慢，可以有效降低姜黃素對正常細胞的毒副作用；當(dāng)pH=5.0時，姜黃素的釋放速率大大加快，120 min后的藥物累積釋放量可以達到37%左右。這說明在藥物釋放過程中，隨著pH值的降低，Cur@MSNs的釋放速率變快。主要原因有以下兩方面：一是隨著pH值的降低，Cur@MSNs的殼越來越變得松軟，有時候甚至?xí)撀洌虼耸沟眉{米材料孔徑變得越來越大，隨之藥物也更容易釋放出來；二是在酸性環(huán)境中，Cur與MSNs的相互作用力遭到破壞，從而促使Cur快速釋放。因此，Cur@MSNs是一種非常優(yōu)良的納米藥物輸送體系，可有效將Cur靶向至腫瘤組織，實現(xiàn)癌癥的靶向治療。

表5 pH=7.4時各組Cur@MSNs的累積藥物釋放率

表6 pH=5.0時各組Cur@MSNs的累積藥物釋放率

3 結(jié)論

本文圍繞介孔二氧化硅納米材料的制備、表征、載藥、體外藥物釋放等展開研究，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不改變TEOS和氨水加入量的情況下，采用水熱合成法所得介孔二氧化硅納米材料孔徑平均在50 nm左右，其中采用酸液萃取法去除表面活性劑CTAB，效果顯著?？紫督Y(jié)構(gòu)分析可知，所制備的MSNs載體均為介孔結(jié)構(gòu)，孔徑分布均勻，適合于藥物載帶。藥物載帶與釋放實驗表明，所制備的Cur@MSNs為典型的pH響應(yīng)藥物載體，在生理pH條件下藥物的包封率和載藥率較高，而在腫瘤組織微環(huán)境中則使藥物快速釋放，為一種非常優(yōu)良的緩控釋藥物載體。

參考文獻：

[1]GLICKMAN M S,SAWYERS C L.Converting cancer therapies into cures:lessons from infectious diseases[J].Cell,2012,148:1089-1098.

[2]王婷婷.基于介孔二氧化硅的多功能納米材料的制備及其在藥物輸送和熒光成像領(lǐng)域的應(yīng)用[D].長春:東北師范大學(xué),2011:1-29.

[3]郝曉紅,張翠妙,劉小龍,等.基于介孔二氧化硅的多功能納米藥物輸送體系研究進展[J].生物化學(xué)與生物物理進展,2013,40(10):1014-1022.

[4]賀利貞.功能化介孔二氧化硅納米載藥體系在腫瘤診療中的應(yīng)用與機制研究[D].廣州:暨南大學(xué),2016:9-12.

[5]SHEN Z Y,LI Y,KOHAMA K,et al.Improved drug targeting of cancer cells by utilizing actively targetable folic acid-conjugated albumin nanospheres[J].Pharmacological Research,2011,63:51-58.

[6]梁旭華,樊君,孫洋,等.葉酸修飾麥角甾酮脂質(zhì)體的制備及體外評價和藥動學(xué)研究[J].中國藥學(xué)雜志,2012,47(12):979-983.

[7]廖素嬋.介孔二氧化硅納米載體介導(dǎo)南蛇藤素抗喉癌作用的研究[D].長春:吉林大學(xué),2016:20-35.

[8]SHEN Z Y,MA G H,DOBASHI T,et al.Preparation and characterization of thermo-responsive albumin nanospheres[J].International Journal of Pharmaceutics,2008,346:133-142.

[9]梁旭華.新型結(jié)構(gòu)稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的制備及其載藥研究[D].西安:西北大學(xué),2015:39-58.