蘇 星，王安平，郭清華,，母義明解放軍總醫(yī)院 內(nèi)分泌科，北京 00853；解放軍總醫(yī)院海南分院 內(nèi)分泌科，海南三亞 5703

垂體柄中斷綜合征(pituitary stalk interruption syndrome，PSIS)是指由于垂體柄的纖細(xì)和(或)缺如導(dǎo)致下丘腦分泌的各種促激素釋放激素不能發(fā)揮生理作用而引起的一系列臨床綜合征，其典型的臨床特征為不同程度的腺垂體激素分泌缺乏，常伴有垂體外中線結(jié)構(gòu)發(fā)育異?；蚧危瑢颊叩纳钯|(zhì)量產(chǎn)生很大的負(fù)面影響。有關(guān)該病的致病因素目前傾向于兩個方面：一是圍生期不良事件對垂體—下丘腦區(qū)域造成損傷；二是先天基因缺陷導(dǎo)致垂體下丘腦的發(fā)育異常[1]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的致病基因有 HESX1、LHX4、PROP1、PROK2、PROKR2、OTX2、SOX3、GPR161、CDON[2-8]。 基因突變極有可能成為其主要的病因，但目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因?qū)е翽SIS發(fā)病的比例還不到5%[9]，提示可能存在其他致病基因未被發(fā)現(xiàn)。垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子-1和垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子祖先蛋白在胚胎早期表達較高，在垂體發(fā)育過程中起著十分重要的作用[10-11]。該基因已經(jīng)在多個種群的矮小型畸形研究中得到了證實，最主要的作用是引起多種垂體激素的缺乏而導(dǎo)致矮小現(xiàn)象的出現(xiàn)[12-13]。為進一步獲得功能性研究的理論依據(jù)，本實驗選取來自于臨床病例中檢測得到的細(xì)胞分化周期蛋白 27(cell division cycle protein 27，CDC27)、神經(jīng)纖維瘤病 1型 (neurofibromatosis type 1，NF1)、X染色體關(guān)聯(lián)的泛素特異性蛋白酶9(ubiquitin specific peptidase 9，X-Linked，USP9X)基因，對3種基因預(yù)先篩選后，研究其對GH3細(xì)胞性狀的影響。

材料和方法

1 主要實驗試劑及儀器 大鼠垂體瘤細(xì)胞(GH3)，購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；F-12K(Thermo公司，美國)；2.5%胎牛血清(FBS，Thermo公司，美國)；15%馬血清(HS，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國)；胰酶(0.25% EDTA，Thermo公司，美國)；RFect細(xì)胞小核酸轉(zhuǎn)染試劑(百代生物科技有限公司，常州)；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8，DojinDo公司，日本)；鼠CDC27單克隆抗體、鼠NF1單克隆抗體、鼠USP9X單克隆抗體、鼠POU1F1單克隆抗體、鼠PROP1單克隆抗體(Santa Cruz生物技術(shù)有限公司，美國)；鼠生長激素放免試劑盒(GH ELISA試劑盒)；鼠泌乳素放免試劑盒(PRL ELISA試劑盒)；鼠促甲狀腺激素放免試劑盒(TSH ELISA試劑盒，健坤生物技術(shù)有限公司，北京)；Millipore超純水制備系統(tǒng)Milli-Q(Millipore公司，美國)；CFX96 RT-PCR儀(BIO-RAD公司，瑞典)；-80℃冰箱(Thermo公司，美國)。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 購買的GH3細(xì)胞保存于解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科實驗室，常規(guī)傳代培養(yǎng)，生長條件為F-12K培養(yǎng)基+ 2.5%FBS + 15%HS。于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 ～ 3 d可傳代1次。

3 siRNA轉(zhuǎn)染初篩培養(yǎng) GH3細(xì)胞至融合度90%時，消化鋪于24孔板，細(xì)胞密度為1×105/孔，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達到50%時開始轉(zhuǎn)染，采用CDC27(sense：5'-GACGACCTTGTCACTGAGTTTGG-3'；anti-sense ：5'-CTGGCTTCTCACCTATTTCAC-3')、NF1(sense：5'-CTCTCTCAGTTGATCATATTGG-3'；anti-sense：5'-CCGAAGTTCGGCTGCATGTTGG-3')、USP9X(sense：5'-CTCGTGGCTCTCCAGTTGGAGGG-3'；anti-sense：5'-GCCAGGTCAGTGTGTGGAAATG-3')(GenePharma公司，上海)小干擾RNA瞬時轉(zhuǎn)染的方式予以轉(zhuǎn)染，均按照12.5×10-6mmol/L、25×10-6mmol/L、50×10-6mmol/L設(shè)置轉(zhuǎn)染梯度。取出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS，Sigma公司，美國)，胰酶，37℃下預(yù)熱，更換為無抗生素培養(yǎng)基，將siRNA分別配制于無血清培養(yǎng)基中，室溫放置5 min。將轉(zhuǎn)染試劑混合液，加至siRNA混合液中，室溫孵育20 min。取轉(zhuǎn)染混合液100μl至24孔板，混勻后入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后2 h收集細(xì)胞，RT-PCR(GoTaq?qPCR Master Mix，Promega生物技術(shù)有限公司，北京)檢測siRNA轉(zhuǎn)染后的敲低效率。

4 siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)篩 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，CDC27選擇siRNA-117和siRNA-1968序列，在25×10-6mmol/L、24 h時達到最佳敲低效率，NF1選擇siRNA-6859和 siRNA-7139序 列， 在 50×10-6mmol/L、24 h時達到最佳敲低效率，USP9X選擇siRNA-910和siRNA-2199序 列， 在 25×10-6mmol/L、24 h時達到最佳敲低效率。三種基因均同時設(shè)置陰性對照(negative control，NC)組和空白細(xì)胞組，運用Western bolt方法檢測沉默后的蛋白水平。

5 總RNA提取和RT-PCR檢測mRNA表達 采用Trizol法按RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國)操作說明提取總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體 系：DNase緩 沖 液 1μl，DNase 1μl，RNA 5μl，RNA 酶抑制劑 0.2μl，超純水 2.8μl。37℃孵育30 min，加1μl終止液，65℃孵育5 min終止反應(yīng)。純化后的RNA進行cDNA模板第一鏈的合成，合成的cDNA稀釋至100μl。RT-PCR反應(yīng)程序按照：95℃下2 min，(95℃ 10 s、55℃ 30 s、60℃ 30 s)35個循環(huán)，65℃下2 min。反應(yīng)結(jié)束后對產(chǎn)物的溶解曲線進行分析，并用2-△△Ct分析數(shù)據(jù)。

6 Western blot檢測蛋白表達 -80℃取出轉(zhuǎn)染處理的GH3細(xì)胞樣品(24孔板中)，每孔加入60μl含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和PMSF的裂解液，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，收集液體至EP管中，4℃輕柔地?fù)u40 min，16 000 r/min，4℃離心10 min，取上清至新的EP管。BCA蛋白濃度測定后，配制8%SDS-PAGE Gel膠，加入樣品1/5體積的4×上樣緩沖液，100℃加熱5 min，脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗CDC27(1∶500)、NF1 (1∶100)、USP9X(1∶ 100)、POU1F1(1∶ 100)、PROP1(1∶100)，4℃水平搖床孵育過夜后，用TBST(譜振生物有限公司，上海)洗滌膜3×10 min，加入相應(yīng)的二抗(1∶5 000)，TBST洗滌3×10 min后，化學(xué)發(fā)光成像儀拍照記錄。

7 CCK-8法檢測GH3細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞鋪24孔板，濃度選擇CDC27 siRNA-117和siRNA-1968 25×10-6mmol/L轉(zhuǎn)染，加上NC組和空白細(xì)胞組。轉(zhuǎn)染完成后胰酶消化細(xì)胞5 min，重新鋪入96孔板，每孔1 000個細(xì)胞。細(xì)胞貼壁過夜后，第2天記為0 d，分別在0 d、1 d、2 d、3 d、4 d檢測細(xì)胞增殖并拍照記錄細(xì)胞，視野選取40×。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度(optical density，OD)，選擇450 nm波長，記錄結(jié)果。該步驟重復(fù)3次。

8 GH3細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞鋪24孔板，重新鋪入24孔板，每孔5×105個細(xì)胞。細(xì)胞貼壁過夜后，直接加入絲裂霉素C處理1 h后，更換含0.1% HS的培養(yǎng)基，劃痕拍照記為0 h，分別在0 h、24 h、48 h拍照，用倒置顯微鏡，于0 h、24 h、48 h下隨機選擇5個200×視野內(nèi)計算遷移到劃痕空隙中的細(xì)胞總數(shù)。通過Image J軟件計算每個視野面積。

9 ELISA檢測細(xì)胞分泌能力 采用ELISA法進行，將GH3細(xì)胞鋪24孔板，轉(zhuǎn)染48 h以后，收集48 h細(xì)胞及上清液，并同時制備標(biāo)準(zhǔn)品梯度，后加入包被有GH抗體、PRL抗體和TSH抗體的酶標(biāo)板，37℃下孵育90 min，依次滴加生物素，37℃下孵育60 min，辣根過氧化物酶工作液，37℃下孵育30 min，洗板后加入底物溶液，37℃下避光孵育150 min，加終止液終止反應(yīng)，相同標(biāo)本設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，在酶標(biāo)儀450 nm測定OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣本OD值所對應(yīng)的濃度。

10統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果采用SPSS19.0進行分析，各實驗獨立重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均檢驗其方差齊性，以±s表示，四組數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，事后檢驗采用LSD法；CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力的比較采用重復(fù)測量方差分析，事后檢驗SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三種siRNA轉(zhuǎn)染初篩 經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后，CDC27在25×10-6mmol/L濃度下，24 h時敲低效率相對較好(P＜0.05，圖1)，這其中CDC27 siRNA-117序列和CDC27 siRNA-1968序列敲低效率為最佳(圖中黑框)；NF1在50×10-6mmol/L濃度下，24 h時敲低效率相對較好(P＜0.05，圖1)，這其中NF1 siRNA-6859序列和NF1 siRNA-7139序列敲低效率為最佳(圖中黑框)；USP9X在50×10-6mmol/L濃度下，24 h時敲低效率相對較好(P＜0.05，圖1)，這其中USP9X siRNA-910序列和USP9X siRNA-2199序列敲低效率為最佳(圖中黑框)。三種基因?qū)?yīng)的最佳敲低效率將進行下一步復(fù)篩實驗。

2 siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)篩 將上述初篩中三種基因各自所能達到的最佳敲低效率的序列選出，NF1和USP9X在WB檢測的蛋白水平的表達上沒有差異(P＞0.05，圖2C ～圖2F)；CDC27敲低效率在蛋白水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05，圖2A、圖2B)。結(jié)果表明CDC27不僅能夠在mRNA水平上達到沉默效應(yīng)，在蛋白水平也能夠達到，而USP9X和NF1無法在蛋白水平上實現(xiàn)敲低，所以最終確定選取CDC27基因進行進一步研究。

3 CDC27 siRNA轉(zhuǎn)染驗證實驗 將siRNA-117和siRNA-1968轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，分別在24 h和48 h各檢測一次蛋白水平。通過Image J分析灰度值，結(jié)果顯示siRNA-117和siRNA-1968轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定，能夠達到預(yù)期的沉默效應(yīng)(P＜0.01，P＜0.05，圖3)。

4 細(xì)胞增殖與細(xì)胞形態(tài) 實驗結(jié)果轉(zhuǎn)染后，CCK-8檢測結(jié)果顯示CDC27沉默組(siRNA-117和siRNA-1968)與對照組(NC組)和空白細(xì)胞組比較，在細(xì)胞的增殖和形態(tài)等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖4和圖5)。

圖 2 三種基因最佳敲低序列蛋白檢測結(jié)果 A、 C、 E： Western bolt檢測CDC27、 NF1、 USP9X蛋白水平； B、 D、 F： 分別為左側(cè)對應(yīng)的灰度值相對量統(tǒng)計圖Fig. 2 Results of optimal silencing efficiency from the three genes A, C and E: Western bolt detections of protein level of CDC27, NF1,and USP9X; B, D and F: the corresponding amount of gray values from the left results

圖 3 CDC27轉(zhuǎn)染后沉默效應(yīng)驗證A：24 h； B：48 hFig. 3 Verifying experiment ofsilencing effect after CDC27 siRNA transfection A：24 h； B：48 h

5 劃痕檢測細(xì)胞遷移能力 相對于對照組，CDC27 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的遷移能力有所下降，且在siRNA-117組中更為明顯(P＜0.05，圖6)。提示CDC27沉默會使GH3細(xì)胞的遷移能力下降。

6 POU1F1與PROP1的表達水平 GH3細(xì)胞在CDC27 siRNA轉(zhuǎn)染后，POU1F1與PROP1表達均明顯低于對照組(P＜0.05，P＜0.01，圖7)。

7 ELISA檢測細(xì)胞分泌能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后，分泌生長激素、泌乳素的能力與對照組相比明顯下降(P＜0.01，P＜0.05，圖8A和圖8B)，促甲狀腺激素分泌未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05，圖8C)。

圖 4 轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖影響。轉(zhuǎn)染細(xì)胞達到沉默效應(yīng)后，各組之間細(xì)胞增殖未見明顯差異Fig. 4 Effects of transfection on cell proliferation. Observations were recorded for consecutive 4 days, and the results showed that there was no significant difference in the cell proliferation between each group

討 論

垂體柄中斷綜合征是內(nèi)分泌與代謝病學(xué)中的一種罕見的綜合征，該疾病的發(fā)展常在胚胎或新生兒期開始，但由于其進展緩慢，常難以引起重視，所引起的臨床癥狀一是外貌方面如面部、顱腦、生殖系統(tǒng)等的畸形；二是功能方面(相關(guān)激素缺乏)如生長、性腺、垂體功能發(fā)育不良[14]。

本研究中，CDC27基因沉默后在mRNA水平和蛋白水平上均能夠呈現(xiàn)有差異性且穩(wěn)定的敲低，達到了預(yù)期的沉默效應(yīng)，后續(xù)的功能性實驗主要是研究CDC27沉默對GH3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。驗證實驗確定成功轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞劃痕和Western bolt的結(jié)果表明，CDC27沉默后GH3細(xì)胞的遷移能力和POU1F1、PROP1的表達水平均有所降低的，且有統(tǒng)計學(xué)差異，提示CDC27與細(xì)胞遷移的調(diào)控可能相關(guān)。研究表明，在機體內(nèi)作為祖先蛋白的PROP1的作用是活化POU1F1基因，進而使其發(fā)揮功能[15-19]。POU1F1基因定位于人體第3號染色體上，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，作為一個在垂體發(fā)育后期起作用的垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子，其在胚胎期的第16天對GH、PRL和TSH分化的能力達到最強，加之這3種激素細(xì)胞均同屬POU1F1細(xì)胞系，所以POU1F1突變對于GH、PRL和TSH發(fā)育的影響也是最大的，因此垂體功能低下可以通過POU1F1突變導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞不完全發(fā)育來解釋[20-24]。針對PROP1基因而言，其在拉克特氏囊前體細(xì)胞遷移中則發(fā)揮著十分重要的作用，并參與垂體器官早期的形成，一旦其表達下降，則后續(xù)的遷移過程便無法完成，使得原本調(diào)控生長激素細(xì)胞增殖的POU1F1無法作用于生長激素釋放激素受體和生長抑素受體，后續(xù)的生長激素分泌便明顯下降，所以PROP1突變與POU1F1突變所引起的激素水平缺乏的結(jié)果往往是類似的，其病理原因正是自身表達水平的下降影響了后續(xù)的細(xì)胞遷移。在一些侏儒鼠模型中，如Snell和Jackson小鼠，POU1F1以及PROP1基因表達量在其體內(nèi)很難測出，同樣這些侏儒鼠體內(nèi)GH、PRL、TSH細(xì)胞較野生正常的同種小鼠均是萎縮的[25]。

圖 5 轉(zhuǎn)染對細(xì)胞形態(tài)影響。轉(zhuǎn)染細(xì)胞達到沉默效應(yīng)之后，各組之間細(xì)胞形態(tài)未見明顯差異(40×)Fig. 5 Effects of transfection on cell morphology. Observations were recorded, and the results showed that there was no significant difference in the cell morphology between each group (40×visual field)

圖 6 細(xì)胞遷移實驗顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力下降 A：顯微鏡下(200×)； B：細(xì)胞遷移即使結(jié)果柱狀圖Fig. 6 Decreased cell migration ability after transfection A：The cells migration results were observed at 0 h, 24 h and 48 h (200×); B:Histogram of cell migration. The migration significantly decreased compared with NC and blank groups

圖 8 CDC27達到沉默效應(yīng)后上清液中生長激素(A)、 泌乳素(B)、 促甲狀腺激素(C)水平Fig. 8 Detections of GH, PRL and TSH from supernatant. A: GH level (ng/ml); B: PRL level (ng/ml); C: TSH level (ng/ml)

Lee等[26]指出胞葬作用、細(xì)胞遷移、神經(jīng)突生長均與一個名為Elmo的蛋白家族有關(guān)(該家族共包含Elmo1、Elmo2、Elmo3三個成員)，其中Elmo1在細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮重要的作用，針對其的磷酸化或其他調(diào)節(jié)作用可能會使其成為后期促進復(fù)合物(anaphase-promoting complex，APC)的底物，而CDC27正是該復(fù)合物中的一個重要組成成分，且作為新伴侶與Elmo1相結(jié)合，但CDC27表達無論高低，對于細(xì)胞的吞噬和凋亡均沒有影響。Nishimura等[27]進一步指出PROP1所表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)錄活性為細(xì)胞類型依賴型，作用位點位于PROP1基因5'端上游區(qū)域和第1號內(nèi)含子的位置處，該作用的發(fā)揮與Notch通路關(guān)系密切；此外還發(fā)現(xiàn)了18種涉及垂體早期器官形成和發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子(均為Notch通路中所包含的因子)，也都是在5'端上游區(qū)域位點參與對PROP1的調(diào)節(jié)，而Notch通路是一個既可以在胚胎期也可以在成體后影響垂體的形態(tài)、增殖及最終垂體結(jié)構(gòu)定位、分化的通路[28-29]。我們的實驗結(jié)果也驗證了CDC27沉默對于GH3細(xì)胞增殖和形態(tài)兩個方面均未產(chǎn)生明顯影響，即在細(xì)胞存活方面與前述的研究是相吻合的，證實了CDC27沉默主要是影響細(xì)胞遷移的過程，也就是說CDC27在細(xì)胞遷移中確實起著重要的作用。

綜上所述，本研究表明，全基因組外顯子測序所得的3種基因，即CDC27、NF1、USP9X，只有CDC27具有在體外實驗驗證的可行性，而且在體外實驗中也驗證了其會對細(xì)胞的遷移有明顯影響，所以推測CDC27的沉默表達可能會在體內(nèi)研究中導(dǎo)致涉及垂體器官發(fā)育重要過程的POU1F1以及PROP1表達的下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞無法完成遷移而發(fā)揮應(yīng)有的生理功能。該結(jié)果可能會對垂體形成發(fā)育產(chǎn)生負(fù)性的影響。當(dāng)然，本研究僅在體外驗證方面取得了一定結(jié)果，可以作為體內(nèi)實驗開展的理論依據(jù)，更多的功能性研究亟待在體內(nèi)實驗中進一步驗證。

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