盧陽陽 關舒會 李玉博 饒欽雄 王偉民 宋衛(wèi)國

摘要

采用乙腈提取，QuEChERS方法凈化，超高壓液相色譜儀檢測的方法，動態(tài)監(jiān)測3種新煙堿類農藥單一及混合使用后青菜中吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪的殘留量變化，并進行吸附動力學分析。結果表明，青菜中3種農藥的殘留量隨時間延長增加，不同處理組分別在24～48 h達到殘留量最高值，之后殘留量緩慢降低并趨于穩(wěn)定。經(jīng)卡方檢驗分析，3種農藥在青菜中的吸附行為更符合準一級動力學模型，且決定系數(shù)R2大部分大于0.9。3種農藥混合使用時存在相互作用，相較于農藥的單獨使用，混用能夠提高各自在青菜中的吸附速率。吡蟲啉與啶蟲脒之間存在相互促進作用，混合使用后各自的殘留量和峰值均提高。但兩者與噻蟲嗪存在抑制作用，混用后青菜中噻蟲嗪的最高殘留量降低。該研究為農藥復合殘留風險評估和田間混合施藥提供了基礎數(shù)據(jù)。

關鍵詞

吡蟲啉； 啶蟲脒； 噻蟲嗪； 殘留吸附； 相互作用

中圖分類號：

S 481.8

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017373

A preliminary study on residue sorption kinetics and combined effects of

three neonicotinoids in leafy vegetables

LU Yangyang1，2， GUAN Shuhui1， LI Yubo1， RAO Qinxiong1， WANG Weimin1， SONG Weiguo1

（1. Institute of AgroProduct Standards and Testing Technology， Shanghai Academy of Agricultural

Sciences， Shanghai Engineering Research Center of Agroproducts Quality and Safety， Shanghai

Service Platform of Agroproducts Quality and Safety Evaluation Technology， Shanghai 201403， China；

2.College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

Abstract

The residues in samples were extracted with acetonitrile， cleaned up by dSPE column， and detected by ultraperformance liquid chromatography， and the pesticide adsorption kinetics were analyzed by dynamically monitoring single and mixed residues of imidacloprid， acetamiprid and thiamethoxam in Brassica chinensis. The results showed that the residues of the three pesticides adsorbed into B.chinensis increased to a maximum value at 24-48 h， then slowly declined， and finally reached a stable state. On the basis of chisquare test， the residue adsorption of three neonicotinoids in leaves conformed to the pseudofirst order kinetic model， with a determination coefficient（R2） of over 0.9.There existed interactions among the three neonicotinoids and the mixing could improve the adsorption rate of residues in B.chinensis； there was a mutual promotion between imidacloprid and acetamiprid by mixing and their residues and peak value were increased. However， imidacloprid or acetamiprid showed an inhibitory effect on thiamethoxam when mixing， and could reduce the maximum residues of thiamethoxam in B.chinensis. This study provided basic data for residue risk assessment and field application of pesticide mixtures.

Key words

imidacloprid； acetamiprid； thiamethoxam； residue sorption； mutual effect

我國是農業(yè)生產大國，也是農藥使用大國，在農產品生產過程中往往會混合施用多種農藥防治病蟲害，致使農產品中檢出多種農藥殘留，形成復合污染。2009年，中國綠色和平組織在北京、上海等幾個城市，對常見蔬果中農藥殘留進行檢測，結果在隨機選擇的45個樣品中，有40個測出了50種農藥殘留，其中有30個樣品至少存在5種以上農藥殘留[1]。2009-2012年對廣東省中山市蔬菜中農藥殘留調查顯示，在1種蔬菜中最多能檢出5種農藥殘留[2]。不同農藥具有不同的分子量、化學結構及官能團，它們的物理性質和化學性質有所不同，導致作物上農藥的殘留情況不同，因此復合污染引起的農產品質量與安全風險的不確定性值得關注[3]。某些農藥混用比單劑具有更好的防治作用[4]，但混合農藥如果施用不當，會對農作物產生藥害[5]。阿維菌素和高效氯氰菊酯、毒死蜱聯(lián)合使用對動物的毒性與各個單劑相比都有所增加[67]，甲基對硫磷和克百威混合使用對人角質形成細胞HaCaT產生協(xié)同作用[8]。相同作用機制的農藥，可能產生相加、協(xié)同等復合效應，并造成累積性危害，風險可能超過單一農藥殘留。

有些國家已經(jīng)開展機理相同的農藥聯(lián)合暴露的風險評估[913]。歐盟食品安全局植物保護產品和殘留科學委員會評估認為復合殘留的風險程度可能被低估，多種農藥殘留同時存在的農產品監(jiān)管也缺乏相應的依據(jù)[1416]。新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪內吸性較強，活性較高，目前被120多個國家登記使用，廣泛用于蔬菜、水果蟲害防治[1718]。然而，我國現(xiàn)行的農產品中農藥殘留風險評估均只針對單一農藥，并沒有對多種農藥同時存在的情形開展評估。本研究以常用的3種新煙堿類農藥為靶標，通過研究其在青菜中的殘留動態(tài)，分析3種農藥混合污染的特征及其相互作用，為評估新煙堿類農藥在食品中的累積性風險提供殘留基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試對象：青菜Brassica chinensis，購于上海市農業(yè)科學院莊行試驗站葉菜基地。

供試農藥：97%吡蟲啉原藥、97%啶蟲脒原藥、96%噻蟲嗪原藥，均來自山東中農聯(lián)合生物科技有限公司。

農藥標準品：99.5%吡蟲啉、99%啶蟲脒、99%噻蟲嗪，均來自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

主要試劑：乙腈（色譜純），上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉（分析純），上海凌峰化學試劑有限公司；CNW dSPE分散固相萃取純化管（150 mg無水硫酸鎂，25 mg PSA，7.5 mg GCB，2mL），上海安譜實驗科技股份有限公司；純凈水，上海娃哈哈飲用水有限公司；超純水，由Millipore超純水儀制備得到。

1.2 儀器與設備

Acquity （BSM/PDA）Waters超高壓液相色譜儀（UPLC），Waters科技有限公司；JY3002電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；SK8210LHC超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司；EPFO945605 Talboys基本型漩渦混合器、EOFO945008 Talboys基本型多管式漩渦混合器，美國Troemner公司；D37520冷凍離心機，德國Thermo公司；5424R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；超純水儀，美國Millipore公司；JYLC022E料理機，九陽股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 浸泡液配制及青菜處理

提前36 h配制高、中、低3種濃度的吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪的浸泡液，高濃度為500 mg/L（1.5 g原藥溶于3 L純凈水）、中濃度為100 mg/L （300 mg原藥溶于3 L純凈水）及低濃度為20 mg/L （60 mg原藥溶于3 L純凈水），分別設置3種農藥單劑處理，二元及三元農藥等濃度混合，即設置以下7個處理組：吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪、吡蟲啉+啶蟲脒、吡蟲啉+噻蟲嗪、啶蟲脒+噻蟲嗪、吡蟲啉+啶蟲脒+噻蟲嗪，各做3個平行。從不同浸泡液中每隔2、6、10、14、24、36、48、60 h取等量青菜，用水沖洗青菜表面游離態(tài)農藥，擦干，勻漿待測。以不加蔬菜的浸泡液和不浸泡農藥的蔬菜為空白組及對照組。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g樣品于離心管中，加10 mL乙腈，渦旋30 min，加2 g NaCl，渦旋1 min，4 500 r/min離心5 min，取1 mL溶液于dSPE純化管中，渦旋1 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，乙腈稀釋到線性范圍，進小瓶待上機。

1.3.3 超高壓液相色譜檢測方法

儀器：UPLC，檢測器為PDA檢測器，流動相為色譜純乙腈（A相）和超純水（B相），色譜柱為CORTECS C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）。柱溫30℃，進樣量5 μL，吸附波長256 nm，流速0.4 mL/min。流動相梯度0～6.0 min，A相從5%升到30%，6.0～6.5 min，A相降到5%，6.5～8.0 min，A相保持5%。

1.3.4 標準曲線的制作及回收率的測定

用色譜純乙腈配制0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/L的吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪的混合標準溶液，分別進樣，繪制定量標準曲線。

在對照樣品中添加吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪標準溶液，添加的濃度分別為0.1、10、100 mg/kg，每個添加濃度設置5個重復，完全混勻后靜置2 h左右，按前述方法進行提取，并進行定量分析，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪的保留時間分別為4.32、4.83和3.35 min，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，做線性回歸曲線，測得吡蟲啉在0.2～8 mg/kg范圍內峰面積與濃度呈線性相關，標準曲線方程為y=14 300x+1 090，決定系數(shù)R2=0.998 1；啶蟲脒的標準曲線方程為y=21 700x+746， 決定系數(shù)R2=0.997 6；噻蟲嗪的標準曲線方程為y=17 400x+1 580，決定系數(shù)R2=0.999 1。

2.2 回收率的測定

吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪在青菜中的平均回收率分別為97.02%～100.17%，98.39%～101.97%，94.32%～96.10%，變異系數(shù)分別為1.35%～5.48%，1.51%～6.37%，1.68%～9.02%，均在允許范圍內符合分析的標準。3種農藥在青菜中的定量限均為0.1 mg/kg。

2.3 農藥復合污染對吸附動力學的影響

不加蔬菜的浸泡液（空白組）中3種農藥的濃度基本無變化，而不浸泡農藥的蔬菜（對照組）未檢出3種農藥。浸泡液中吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪的最大濃度為500 mg/L，3種農藥能完全溶解。所有處理中的3種農藥在青菜中的殘留均呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢。隨著時間推移，青菜中的農藥殘留量增加，不同處理分別在24～48 h到達殘留峰值，即到達吸附平衡，之后殘留量緩慢降低并趨于穩(wěn)定（圖1）。

式中，qe1與qe2為吸附平衡時青菜中農藥的含量（mg/kg），qt為時間t時青菜中農藥的含量（mg/kg），k1為準一級動力學反應速率常數(shù)（1/h），k2為準二級動力學反應速率常數(shù)（kg/（mg·h））。擬合所得的相關參數(shù)如表2所示。準一級動力學模型的決定系數(shù)R2在0.863 5～0.994 4范圍內，準二級動力學模型的決定系數(shù)R2在0.865 6～0.999 8范圍內。

采用卡方檢驗法對吸附殘留量實際值qt與理論預測值qe1和qe2進行分析比較，準一級動力學的卡方值為18.115，準二級動力學的卡方值為174.927，由于實際值與理論值之間的偏離程度決定卡方值的大小，且卡方值越小，預測值越符合實際值，說明青菜吸附3種農藥的過程更符合準一級動力學模型。單獨施藥下準一級動力學的卡方值為3.680，準二級動力學的卡方值為64.164，混合施藥下準一級動力學的卡方值為14.435，準二級動力學的卡方值為110.762，單獨施藥及混合施藥下的準一級動力學的卡方值均比準二級動力學小。無論單獨施藥還是混合施藥，青菜吸附農藥的過程均更符合準一級動力學模型。

2.4 青菜中3種農藥殘留的相互作用

采用SPSS17.0軟件分別對高、中、低3個不同濃度的殘留量數(shù)據(jù)進行多因素分析，結果表明，吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪的殘留量差異顯著（P<0.001），表明在不同濃度浸泡液中青菜吸附單一農藥殘留量存在極顯著差異；且在同一濃度下，單獨施藥與混合施藥后的某一農藥殘留量也存在顯著差異（P<0.001），表明青菜在單獨及混合農藥中的吸附殘留量存在極顯著差異。

如圖1所示，20 mg/L低濃度藥液處理后，青菜中吡蟲啉實際殘留峰值在吡蟲啉、吡蟲啉+啶蟲脒、吡蟲啉+噻蟲嗪、吡蟲啉+啶蟲脒+噻蟲嗪處理中分別為4.962、5.992、5.848、9.072 mg/kg，青菜中啶蟲脒殘留峰值在啶蟲脒、吡蟲啉+啶蟲脒、啶蟲脒+噻蟲嗪、吡蟲啉+啶蟲脒+噻蟲嗪處理中分別為5.230、5.552、6.536、5.848 mg/kg，青菜中噻蟲嗪殘留峰值在噻蟲嗪、吡蟲啉+噻蟲嗪、啶蟲脒+噻蟲嗪、吡蟲啉+啶蟲脒+噻蟲嗪處理中分別為5.416、3.434、3.066、3.866 mg/kg；低濃度下，混合使用后吡蟲啉與啶蟲脒的殘留峰值均比單獨使用高，但噻蟲嗪混合使用的殘留峰值比單獨使用低。100 mg/L中濃度藥液處理后，吡蟲啉+啶蟲脒混用處理中吡蟲啉、啶蟲脒的殘留峰值21.293 mg/kg、23.079 mg/kg高于單獨使用和其他混用處理；其他混用處理中，兩者的最高殘留量均受到噻蟲嗪的抑制，青菜吡蟲啉殘留峰值在吡蟲啉+噻蟲嗪處理中為17.082 mg/kg，在吡蟲啉+啶蟲脒+噻蟲嗪處理中為17.647 mg/kg，均低于吡蟲啉單用中的19.266 mg/kg，青菜中啶蟲脒殘留峰值在啶蟲脒+噻蟲嗪處理中為21.055 mg/kg，在吡蟲啉+啶蟲脒+噻蟲嗪處理中為19.173 mg/kg，均低于啶蟲脒單用中的22.087 mg/kg，噻蟲嗪的殘留量也被吡蟲啉、啶蟲脒抑制，混用后青菜中噻蟲嗪殘留峰值（吡蟲啉+噻蟲嗪處理中13.988 mg/kg、啶蟲脒+噻蟲嗪處理中14.792 mg/kg、吡蟲啉+啶蟲脒+噻蟲嗪處理中16.813 mg/kg）低于噻蟲嗪單用（17.620 mg/kg）。較高的500 mg/L濃度藥液處理后，混用后吡蟲啉、啶蟲脒殘留峰值與20 mg/L施藥濃度的趨勢基本一致，與噻蟲嗪相互抑制。

結果顯示，高、中、低3種濃度下，吡蟲啉與啶蟲脒可相互提升彼此的最高殘留量，但兩者均可降低噻蟲嗪的最高殘留量。低濃度下噻蟲嗪促進吡蟲啉、啶蟲脒最高殘留量的提升，當處理濃度提高至100 mg/L后，噻蟲嗪則表現(xiàn)出對另兩種農藥殘留峰值的抑制作用。將殘留峰值與吸附速率結合進行綜合分析，3種農藥二元或三元混用后吸附速率均增加，吡蟲啉與啶蟲脒之間相互促進，致使殘留峰值也隨之增加。但噻蟲嗪的殘留峰值卻因受到吡蟲啉、啶蟲脒的抑制，導致吸附峰值會有所下降。

3 討論

本文以吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪3種農藥單獨及混合浸泡的方式，對青菜中農藥的殘留量進行動態(tài)分析，QuEChERS法前處理，UPLCPDA檢測，方法可靠。隨時間延長，青菜吸附浸泡液中3種農藥的量逐漸增加，于24～48 h不同時間點分別到達殘留峰值，即到達吸附平衡，最后殘留量緩慢降低并趨于穩(wěn)定?？ǚ綑z驗法分析得到青菜吸附3種農藥的過程更符合準一級動力學模型。分析該模型擬合得到的平衡時吸附量及表征吸附速率的速率常數(shù)，3種農藥二元或三元混合使用后吸附速率均增加，混用對單個農藥吸附速率均具有促進作用。吡蟲啉與啶蟲脒之間的相互促進作用致使殘留峰值也隨之增加，但噻蟲嗪的殘留峰值卻因受到吡蟲啉、啶蟲脒的抑制而有所降低。本研究針對3種新煙堿類農藥的復合污染進行了初步探索，證明了相互之間存在的促進、抑制等作用。從另一方面表明，農藥混用要講究方式方法，綜合考慮防治效果和安全兩方面因素，如吡蟲啉和啶蟲脒之間具有相互促進作用，則盡量避免兩者混用和輪換使用，但可選擇與噻蟲嗪混用。

在病蟲害防治過程中，為了減少抗藥性，增加防治譜，人們往往會采用混劑和輪換使用農藥的方式。目前，我國指定的農藥限量只考慮單一農藥的風險，對產品的監(jiān)管和監(jiān)測也以單項指標為判定依據(jù)，并沒有考慮到多種農藥同時存在的相互作用問題，也沒有考慮到農藥同時或先后作用所產生的效應。本研究證明了3種作用機制相同農藥互相之間存在促進或抑制作用，初步揭示了農藥之間存在復合污染效應，并依據(jù)農藥品種和劑量的不同而有所變化。COT[19]通過研究證明，人同時或先后暴露多種農藥殘留相對于一種農藥殘留來說，會引起更高或更低的聯(lián)合效應；KIM等[20]報道20種化學物質可能有190多種二元聯(lián)合毒性作用。李耘等[21]研究發(fā)現(xiàn)農藥的聯(lián)合毒性會隨著混合物之間的濃度比例、存在的先后順序及暴露時間等條件的不同而不同。但復合污染的機理，仍需開展更進一步的試驗來揭示。李昕馨等[22]指出低劑量混合化學物更有利于建立完整、統(tǒng)一的混合污染毒理及風險評價體系，應從更低水平出發(fā)，依靠生物學的理論與技術，在生物組織、細胞、分子、基因水平上確定混合物之間的相互作用及劑量范圍等。所以，今后的方向需要側重的不僅僅是同類農藥、同一濃度配比以及同一暴露時間，還需對多種藥的多種配比及不同暴露時間等進行研究，并在細胞分子水平上進行低劑量研究，以期在未來能夠確定所有農藥的相互作用及相應的安全劑量，并預測聯(lián)合毒性效應。

參考文獻

[1] 陳晨.農藥殘留混合污染聯(lián)合毒性效應研究[D].北京：中國農業(yè)科學院，2014.

[2] 高潔，李擁軍，范淑嬌，等.20092012年中山市蔬菜農藥殘留現(xiàn)狀調查研究[J].現(xiàn)代農業(yè)科技，2013（13）：137138.

[3] 施海萍，葉建人，蔡娟娟，等.農藥不同使用方法影響作物上農藥殘留量的試驗研究[J].中國植保導刊，2004，24（5）：3233.

[4] 劉長令.世界農藥大全：殺蟲劑卷[M].北京：化學工業(yè)出版社，2012.

[5] 蔣新宇.鎘毒死蜱復合污染對土壤酶活性和青菜生長的影響[D].江蘇：南京農業(yè)大學，2009.

[6] 馮小雨，安連杰，焦冬，等.阿維菌素與高效氯氰菊酯聯(lián)合對大鼠脂質過氧化影響[J].中國公共衛(wèi)生，2014，30（3）：308311.

[7] 安連杰，馮小雨，巴婧，等.阿維菌素與毒死蜱聯(lián)合作用對大鼠脂質過氧化的影響[J].工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2013，39（6）：343347.

[8] ABHISHEK A， ANSARI N G， SHANKHWAR S N， et al. In vitro toxicity evaluation of low doses of pesticides in individual and mixed condition on human keratinocyte cell line[J]. Bioinformation， 2014， 10（12）：716.

[9] EPA （U. S. Environmental Protection Agency）. Organophosphorus cumulative risk assessment （2006 update）[EB/OL].（20060731）[20170601].https：∥www.regulations.gov/document？D=EPAHQOPP200606180002.

[10]EPA（U. S. Environmental Protection Agency）. Revised Nmethyl carbamate cumulative risk assessment [EB/OL].（20070924）[20170601].https：∥www.regulations.gov/document？D=EPAHQOPP200803470029.

[11]EPA （U. S. Environmental Protection Agency）. Triazine cumulative risk assessment [EB/OL]. （20060328）[20170601]. https：∥www.regulations.gov/document？D=EPAHQOPP200504810003.

[12]EPA（U. S. Environmental Protection Agency）. Cumulative risk from chloroacetanilide pesticides[EB/OL]. （20060328）[20170601]. https：∥www.regulations.gov/document？D=EPAHQOPP200602020002.

[13]EPA（U. S. Environmental Protection Agency）. Pyrethrins/pyrethroid cumulative risk assessment[EB/OL]. （20071004）[20170601]. https：∥www.regulations.gov/document？D=EPAHQOPP201107460003.

[14]EFSA. Scientific opinion on risk assessment for a selected group of pesticides from the triazole group to test possible methodologies to assess cumulative effects from exposure through food from these pesticides on human health on request of EFSA [J]. The EFSA Journal， 2009， 7（9）： 1167.

[15]楊桂玲，陳晨，王強，等.農藥多殘留聯(lián)合暴露風險評估研究進展[J].農藥學學報，2015，17（2）：119127.

[16]陳晨，錢永忠.農藥殘留混合污染聯(lián)合效應風險評估研究進展[J].農產品質量與安全，2015（5）：4953.

[17]胡笑形.農藥手冊[M].北京：化學工業(yè)出版社，2014：7，574，990.

[18]張梅鳳，范金勇，張宏偉，等.新煙堿類殺蟲劑的研究進展[J].世界農藥，2009，31（1）：2225.

[19]COT （UK Committee on Toxicity of Chemicals in Food， Consumer Products and the Environment）. Risk assessment of mixtures of pesticides and similar substances [EB/OL]. （20020901）[20170601]. https：∥www.food.gov.uk/sites/default/files/cot/reportindexed.pdf.

[20]KIM J， KIM S， SCHAUMANN G E. Reliable predictive computational toxicology methods for mixture toxicity： toward the development of innovative integrated models for environmental risk assessment[J]. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology， 2013，12（3）：235256.

[21]李耘，錢永忠，陳晨，等.混合化學物風險評估技術及研究進展[J].農產品質量與安全，2013（6）：4248.

[22]李昕馨，宋玉芳，張薇，等.低劑量混合污染生態(tài)毒理與風險評價研究進展[J].應用生態(tài)學報，2006，17（7）：13261330.

（責任編輯：田 喆）