林源活性成分納米載體的安全性評價研究

楊少宗 劉本同 錢華等

摘要 [目的]評價人血清白蛋白納米顆粒載體以及林源活性成分納米顆粒制劑的安全性。[方法]以人血清白蛋白制備納米顆粒載體，包埋紅豆杉屬植物抗癌活性成分紫杉醇及其衍生物多西紫杉醇，開展細(xì)胞實驗和動物實驗。[結(jié)果]與紫杉醇和多西紫杉醇市售制劑的溶劑相比，納米顆粒載體對MCF-7細(xì)胞和C57BL/6 小鼠的毒性比較小；紫杉醇和多西紫杉醇的納米顆粒制劑對BALB/C-nu/nu裸鼠的最大耐受劑量大于市售制劑Taxol和Taxotere （40、30 mg/kg）。[結(jié)論]紫杉醇和多西紫杉醇的納米顆粒制劑有很大的市場前景，而蛋白納米載體技術(shù)在林源活性成分的應(yīng)用研究中具有重要的推廣價值。

關(guān)鍵詞 林源活性成分；納米載體；人血清白蛋白；安全性評價

中圖分類號 S789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）32-0102-04

Safety Evaluation on the Nanocarrier of the Active Ingredients from Forest

YANG Shaozong，LIU Bentong，QIAN Hua et al （Institute of Forest Food，Zhejiang Academy of Forestry，Hangzhou，Zhejiang 310023）

Abstract [Objective] To evaluate the safety of the human serum albumin nanoparticle carrier and active ingredientsloaded nanoparticle formulation.[Method] A human serum albumin nanoparticle was designed to deliver paclitaxel and docetaxel，the anticancer ingredients derived from the bark of the Pacific yew or Western yew tree （Taxus Linn.）.In vitro experiments in human breast cancer MCF7 cells and in vivo experiments in C57BL/6 mice and BALB/Cnu/nu nude mice were performed.[Result]The toxicity of human serum albumin nanoparticle carrier to the MCF7 cells and C57BL/6 mice was much less than that of the solvents in the Taxol and Taxotere .The maximum tolerated dose of paclitaxel/docetaxelloaded nanoparticle formulations was higher than that of Taxol and Taxotere （40，30 mg/kg） in BALB/Cnu/nu nude mice.[Conclusion] The paclitaxel/docetaxelloaded nanoparticle formulation will possess good market prospect.The proteinbased nanocarrier has important value for extension and application of active ingredients from forest.

Key words Active ingredients from forest；Nanocarrier；Human serum albumin；Safety evaluation

基金項目 浙江省自然科學(xué)基金項目（LQ15C160001）；中央財政林業(yè)科技推廣示范資金項目（〔2017〕TS01）。

作者簡介 楊少宗（1974—），男，安徽阜陽人，副研究員，博士，從事林源中藥活性成分開發(fā)研究。*通訊作者，副教授，博士，從事蛋白納米技術(shù)應(yīng)用研究。

收稿日期 2018-09-18

林源活性成分是指存在于木本植物體內(nèi)的除水分、糖、蛋白質(zhì)、脂肪以外的次生代謝產(chǎn)物，例如萜類、黃酮、生物堿、甾體、木質(zhì)素、礦物質(zhì)等。林源活性成分來源廣泛，具多種功能，被廣泛應(yīng)用于功能性食品及藥品的開發(fā)。然而，在具體應(yīng)用時存在不穩(wěn)定、水溶性差等問題，導(dǎo)致其生物利用度低。如何高效利用林源活性成分不僅是食品和醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題，而且是林業(yè)科技發(fā)展不可或缺的研究內(nèi)容[1-2]。

在提高活性物質(zhì)功效的研究中，載體的應(yīng)用十分廣泛。納米載體是一種納米級微觀范疇（<100 nm）的亞微粒輸送系統(tǒng)，具有納米尺寸效應(yīng)及較高的比表面積，展現(xiàn)了諸多優(yōu)點：增加包埋成分水溶性、克服生物學(xué)屏障、具靶向性、控制藥物釋放[3-5]。然而，各種研究表明，載體在提高被包埋成分的活性作用的同時，也帶來了新的安全隱患。因此，理想的藥物載體除了功能性還應(yīng)具有良好的安全性[6-7]。

該研究以人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）作為納米載體的制備材料，包埋紅豆杉[Taxus chinensis （Pilger） Rehd.]的抗癌活性成分紫杉醇（paclitaxel，PTX）及其衍生物多西紫杉醇（docetaxel，DOC），以市售的紫杉醇制劑Taxol和多西紫杉醇制劑Taxotere為參照，利用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、C57BL/6 小鼠和BALB/C-nu/nu裸鼠展開實驗，通過細(xì)胞存活率（cell survival rate，CSR）、給藥前后體重變化以及最大耐受劑量（the maximum tolerated dose，MTD）等指標(biāo)對人血清白蛋白納米載體的安全性及紫杉醇（多西紫杉醇）納米顆粒制劑的毒理進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫杉醇和多西紫杉醇購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；人血清白蛋白（第5組分，A-1653）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，色譜純）購自美國Sigma公司；Taxol購自意大利Bristol-Myers Squibb 公司；Taxotere購自法國Sanofi公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Penicillin-Streptomycin購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。其他藥品均為國產(chǎn)色譜純或分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 細(xì)胞株和實驗動物 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。C57BL/6 小鼠，SPF級，雌性，6～8周齡；BALB/C-nu/nu裸鼠，SPF級，雄性，6～8周齡，實驗動物購自上海BK公司。

1.3 方法

1.3.1 納米顆粒的制備。

1.3.1.1 人血清白蛋白納米顆粒（HSANP）。將人血清白蛋白儲存液稀釋后加入30% （V/V） DMSO溶液，攪拌混勻5 min（500 r/min），靜置可得人血清白蛋白納米顆粒溶液，冷凍干燥機(jī)處理48 h后去除溶液中的水和DMSO，得到人血清白蛋白納米顆粒凍干粉末。

1.3.1.2 包埋紫杉醇/多西紫杉醇的納米顆粒。將人血清白蛋白儲存液稀釋后加入適量以DMSO為溶劑的紫杉醇/多西紫杉醇溶液，最終體系中人血清白蛋白和紫杉醇/多西紫杉醇的摩爾比為1∶10，DMSO的量維持在30% （V/V），攪拌混勻5 min（500 r/min），靜置可得包埋紫杉醇/多西紫杉醇納米顆粒溶液，冷凍干燥機(jī)處理48 h后去除溶液中的水和DMSO，可得凍干粉末，復(fù)溶后離心30 min（10 000 r/min），取上清液再次冷凍干燥即可得包埋紫杉醇納米顆粒粉末（HSANP-PTX）和包埋多西紫杉醇納米顆粒粉末（HSANP-DOC）。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物作用。將

細(xì)胞置于10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞。所有實驗藥物以生理鹽水為溶劑，配成儲備液，在使用前，直接用培養(yǎng)基稀釋到設(shè)定濃度，以生理鹽水為空白對照組。

1.3.3 細(xì)胞毒性實驗。

細(xì)胞毒性實驗采用CCK-8法[8-9]：取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.025%胰蛋白酶消化后重懸、DMEM培養(yǎng)基稀釋至100個/μL；將細(xì)胞種于96孔培養(yǎng)板中，每孔50 μL，加入DMEM稀釋的藥物50 μL，在未計入培養(yǎng)基的孔中補(bǔ)加100 μL 緩沖液；將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出后每孔加入CCK-8溶液10 μL孵育1 h；在450 nm波長下檢測OD值，通過公式（1）計算CSR。

CSR=ODtest-ODblankODcontrol-ODblank×100%（1）

1.3.4 荷瘤裸鼠模型的建立。

將對數(shù)期的MCF-7細(xì)胞制備成1.0×107個/mL的單細(xì)胞懸液，取6～8周齡裸鼠，于左前肢腋下皮下注射細(xì)胞懸液0.2 mL，建立皮下移植瘤裸鼠模型，建模后繼續(xù)在人工光照環(huán)境下喂養(yǎng)，腫瘤體積達(dá)200 mm3時待用。

1.3.5 C57BL/6小鼠給藥方案。

將C57BL/6小鼠分為9組，每組10只。采取尾靜脈注射給藥，給藥體積10 mL/kg，連續(xù)給藥10 d，每次劑量相同。給藥后觀察小鼠30 min，記錄小鼠進(jìn)食、飲水、體溫等情況，并分別于第1次給藥前1 d和停藥后第2天稱取小鼠體重。

1.3.6 荷瘤裸鼠給藥方案。將BALB/C-nu/nu裸鼠分為16組，每組6只。采取尾靜脈注射給藥，給藥體積10 mL/kg，于接種后第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天給藥，每次劑量相同。給藥后觀察裸鼠30 min，記錄小鼠進(jìn)食、飲水、體溫等情況，并分別于第1次給藥前1 d和停藥后第2天稱取小鼠體重。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)比較采用雙側(cè)T檢驗，P<0.05表示差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 人血清白蛋白納米顆粒載體的安全性評價

2.1.1 人血清白蛋白納米顆粒載體的細(xì)胞毒理分析。

以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為模型，以市售制劑Taxol的溶劑CrEL[聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇（50∶50，V/V）]和Taxotere的溶劑T80[吐溫-80和13%乙醇（25∶75，V/V）]為參照，對人血清白蛋白納米顆粒載體的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究。由表1可知，在HSANP的所有處理組中，CSR均>90%，表明MCF-7細(xì)胞生長不受HSANP的影響。然而，在CrEL和T80中，MCF-7細(xì)胞生長明顯受阻，且隨著處理濃度的增大，CSR顯著下降。該結(jié)果表明，人血清白蛋白納米顆粒作為林源活性成分的載體，與助溶溶劑相比，其細(xì)胞毒性非常小。

2.1.2 人血清白蛋白納米顆粒載體對C57BL/6小鼠生長的影響。HSANP 3個劑量組的小鼠給藥后無異常，實驗期間飲食、行為無明顯改變，無死亡現(xiàn)象發(fā)生。而CrEL和T80的實驗組中，中劑量給藥后出現(xiàn)靜臥、冷漠，30 min后基本恢復(fù)，高劑量組給藥后出現(xiàn)昏厥，CrEL組有4只小鼠死亡，T80組有3只小鼠死亡，剩余小鼠30 min后逐漸恢復(fù)。所有小鼠給藥前后體重的變化如表2所示，在人血清白蛋白納米顆粒載體3個實驗組中，小鼠體重在給藥前后均未發(fā)生顯著性變化，而在2種溶劑的不同劑量實驗組中，小鼠體重在給藥前后均發(fā)生了顯著性變化，且隨著劑量的增加，體重減輕現(xiàn)象愈加明顯。由此可知，與助溶溶劑相比，人血清白蛋白納米顆粒載體對小鼠的生長影響較小。

2.2 紫杉醇（多西紫杉醇）納米顆粒的安全性評價

荷瘤裸鼠對Taxol、Taxotere、HSANP-PTX和HSANP-DOC的MTD結(jié)果見表3，Taxol實驗組中荷瘤裸鼠在30 mg/kg時給藥后就表現(xiàn)出靜臥、冷漠，在40 mg/kg時給藥后昏厥，并有部分裸鼠（4/6）死亡，在50 mg/kg時所有裸鼠給藥后立即死亡；Taxotere實驗組中荷瘤裸鼠在30 mg/kg時給藥后表現(xiàn)出靜臥、冷漠，在40 mg/kg時給藥后昏厥，并有部分裸鼠（3/6）死亡，在50 mg/kg時所有裸鼠給藥后立即死亡；HSANP-PTX在30、40 mg/kg時給藥后均表現(xiàn)正常，在50 mg/kg時，給藥后出現(xiàn)靜臥、冷漠，30 min后精神狀態(tài)基本恢復(fù)；在60 mg/kg時出現(xiàn)昏厥，部分裸鼠（3/6）死亡。HSANP-DOC在30、40 mg/kg時給藥后均表現(xiàn)正常，在50 mg/kg 時，給藥后出現(xiàn)靜臥、冷漠，30 min后精神狀態(tài)基本恢復(fù)，其中有1只裸鼠給藥后昏厥，30 min 后未恢復(fù)，發(fā)生死亡；在60 mg/kg時出現(xiàn)昏厥，部分裸鼠（4/6）死亡。

所有組別在給藥前后體重的變化見圖1。在市售制劑Taxol和Taxotere實驗組中，2個較低劑量（20、30 mg/kg）裸鼠的體重在給藥前后變化不顯著，這與實驗的實施方案有關(guān)，荷瘤裸鼠的給藥是在裸鼠瘤體長至（200±20）mm3時進(jìn)行，裸鼠稱量的體重均為裸鼠本身體重加上瘤體重量。在較低劑量時，雖然藥物Taxol和Taxotere對裸鼠生長有影響，但瘤體的增長導(dǎo)致最終體重未減輕或有所增加。在劑量增加至40、50 mg/kg時，體重減輕很明顯（減輕量>10%）。在HSANP-PTX和HSANP-DOC實驗組中，裸鼠體重也隨劑量的增加而減少，但與Taxol和Taxotere相比，劑量的影響程

度要小，當(dāng)劑量為30、40 mg/kg時，HSANP-PTX和HSANP-DOC實驗組裸鼠的體重?zé)o顯著性變化，當(dāng)劑量增至50、60 mg/kg時，裸鼠體重明顯減輕（>10%）。MTD定義為觀察期內(nèi)不引起動物死亡且動物體重減少不超過10%的最大劑量[10-11]。綜上所述，對于裸鼠來說，市售制劑Taxol和Taxotere的MTD為30 mg/kg，這與文獻(xiàn)報道的Taxol和Taxotere在小鼠上的MTD為20～40 mg/kg是符合的[12-14]，而HSANP-PTX和HSANP-DOC為40 mg/kg。

3 結(jié)論與討論

為評價人血清白蛋白納米顆粒作為載體應(yīng)用于林源活性成分的安全性，展開了細(xì)胞實驗和動物實驗，并以市售制劑Taxol和Taxotere

為參照，研究了人血清白蛋白納米顆粒載體對細(xì)胞生長和動物生存的影響。數(shù)據(jù)表明，與市售制劑中的溶劑相比，人血清白蛋白納米顆粒載體不論是對MCF-7細(xì)胞還是對C57BL/6小鼠毒性作用都很小。林源活性成分紫杉醇和多西紫杉醇占據(jù)抗腫瘤藥物市場植物提取物單品排名的前2位，具廣譜抗腫瘤性，然而研究證明他們對正常人體組織也有毒性。因此，Taxol和Taxotere使用后對人體的傷害一部分是溶劑造成的，例如CrEL導(dǎo)致的超敏反應(yīng)，而另一部分傷害與紫杉醇（多西紫杉醇）本身毒性有關(guān)。之前的研究表明，人血清白蛋白納米顆粒載體對包埋的活性成分（紫杉醇和多西紫杉醇）有很好的緩釋作用，從而可以降低紫杉醇/多西紫杉醇對機(jī)體組織的毒性[15-18]。由荷瘤裸鼠的最大耐受劑量實驗數(shù)據(jù)表明，與Taxol和Taxotere相比，HSANP-PTX和HSANP-DOC的毒性要小，前者的MTD為30 mg/kg，后者為40 mg/kg，證明被納米顆粒載體包埋后的紫杉醇/多西紫杉醇的毒性得到了緩解。

綜上所述，對于林源活性成分紫杉醇和多西紫杉醇來說，與溶劑型制劑相比，由人血清白蛋白納米顆粒載體包埋的制劑安全性更高。同時結(jié)合之前對于HSANP-PTX和HSANP-DOC抗癌活性的研究結(jié)果[18]，可得出結(jié)論：與溶劑型制劑相比，紫杉醇和多西紫杉醇的納米顆粒制劑更具優(yōu)勢，具有很大的市場前景，也證明蛋白納米載體在林源活性成分的應(yīng)用研究中具有重要的推廣價值。

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