施鉀調(diào)控?zé)煵莞捣铀岬尼尫偶捌浞揽厍嗫莶⊙芯?/h1>
2018-05-14 08:59陳娜高翔涂攀峰
安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年23期
陳娜 高翔 涂攀峰
摘要 [目的]對施鉀調(diào)控?zé)煵莞捣铀岬尼尫偶捌浞揽厍嗫莶∵M(jìn)行研究。[方法]通過田間試驗研究施用不同量的鉀肥對煙草青枯病的防控效果，同時測定根系分泌物中的酚酸種類和含量，及其對煙草青枯病病原菌（Ralstonia solanacearum）的抑制作用。[結(jié)果]當(dāng)田間施用150 kg/hm.2的鉀肥時，煙草青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)最低，根際土壤中青枯病病原菌的數(shù)量最少，為5.6 log CFU/g，而無鉀肥處理的發(fā)病程度最高。同時，測定煙草根系分泌物中的酚酸發(fā)現(xiàn)，150 kg/hm.2處理的肉桂酸、水楊酸和苯丙酸釋放量最高。外源添加酚酸對青枯病病原菌的生長結(jié)果表明，低濃度促進(jìn)了菌絲生長，當(dāng)濃度達(dá)600 mg/L 時則表現(xiàn)為抑制作用。此外，在田間中施鉀肥顯著提高了煙草的生物量、鉀濃度和總酚含量。[結(jié)論]施用150 kg/hm.2鉀肥時，能在農(nóng)業(yè)上有效地防控?zé)煵萸嗫莶。涓捣置谖镏械姆铀崮茱@著抑制致病菌的生長。
關(guān)鍵詞 煙草青枯??；鉀肥；發(fā)病率；酚酸
中圖分類號 S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0118-03
Abstract [Objective]To study the regulation on control of tobacco bacterial wilt and phenolic acid release from tobacco roots by application of potassium fertilizer.[Method] The effect of different amount of potassium fertilizer on tobacco bacterial wilt was studied by field experiments， and the inhibitory effect of the pathogen of Ralstonia solanacearum on phenolic acids from root exudates was determined. [Result]When the application of potassium fertilizer was 150 kg/hm.2 in field trial， the incidence and index of tobacco bacterial wilt were the lowest， the number of R. solanacearum in rhizosphere soil was least， which was 5.6 log CFU/g， but no potassium treatment was the worst. Meanwhile， analysis of phenolic acids showed that the 150 kg/hm.2 treatment had the highest amount of cinnamic acid， salicylic acid and phenylpropionic acid from tobacco root exudates. Exogenous phenolic acids added to affect the growth on the pathogen of R. solanacearum showed that low concentration promoted the growth， and the inhibitory effect was achieved when the concentration reached 600 mg/L. In addition， potassium application were significantly increased tobacco biomass， potassium concentration and total phenol content in field trial. [Conclusion]The application of 150 kg/hm.2 potassium fertilizer could effectively control tobacco bacterial wilt in field trial， and the phenolic acids from root exudates could significantly inhibit the growth of R. solanacearum.
Key words Tobacco bacterial wilt；Potassium fertilizer；Disease incidence；Phenolic acids
煙草（Nicotiana tabacum L）是茄科煙草屬經(jīng)濟(jì)作物，在我國主要種植于長江流域和西南地區(qū) [1-2]。處于我國西部地區(qū)的貴州省由于具有優(yōu)越的土地資源和水利條件，因此適宜煙草種植[2-3]，但長期連續(xù)種植煙草，以及氣溫高和空氣濕度大等環(huán)境因素，導(dǎo)致煙草病害發(fā)生嚴(yán)重，特別是難以防治的土傳病害，容易造成煙草產(chǎn)量和品質(zhì)下降[3-4]。煙草青枯病是一種危害嚴(yán)重的土傳維管束病害，由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起，發(fā)病后煙草葉片支脈間出現(xiàn)黑色的斑紋，根系變黑腐爛，最終整棵植株葉片枯萎[4]。使用化學(xué)農(nóng)藥雖然能控制病害的發(fā)生和傳播，但是過量使用農(nóng)藥不但造成煙葉品質(zhì)下降，還容易造成環(huán)境污染問題[4-5]。利用科學(xué)的施肥策略防控病害發(fā)生，對提高煙草產(chǎn)量和品質(zhì)，以及維持煙草產(chǎn)業(yè)的持續(xù)性發(fā)展，具有重要的理論和實踐意義。
鉀是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一，其參與植物生理過程中的各種生化反應(yīng)，還能增強(qiáng)植物在病蟲害、干旱、鹽害等脅迫下的抗逆能力[6-7]，也能調(diào)控植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（例如酚類）抵抗病原菌的侵染[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，施鉀肥能有效抑制檸檬流膠病、玉米莖腐病、山茱萸炭疽病和油菜黑斑病的發(fā)生[6-9]。目前關(guān)于鉀對植物的抗性機(jī)理研究主要在地上部分，而地下部根系是植物吸收營養(yǎng)和水分的主要器官[9-10]。根系分泌物能為土壤微生物提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)，且分泌物中的酚酸物質(zhì)與連作障礙有密切的關(guān)系[10-11]。筆者在前人研究基礎(chǔ)上，通過設(shè)置田間試驗，研究不同施鉀肥水平對煙草青枯病的防控效果，鑒定煙草根系分泌物中酚酸的種類和含量，并測定這些酚酸對抑制煙草青枯病病原菌生長的影響。
1 材料與方法
1.1 試驗地及材料
試驗于2017年在貴州省畢節(jié)地區(qū)煙草種植試驗地進(jìn)行，土壤基本理化性質(zhì)：pH 5.5，有機(jī)質(zhì)12.3 g/kg、速效氮114.8 mg/kg、速效磷13.9 mg/kg、速效鉀98.2 mg/kg。煙草移栽時間為2017年4月13日，煙草青枯病調(diào)查時間為7月8日。選用煙草品種為青枯病敏感品種DJY。
1.2 試驗方法
田間試驗設(shè)置5個處理，分別為K0無鉀肥；K75施用75 kg/hm.2 鉀肥；K150施用150 kg/hm.2 鉀肥；K225 施用225 kg/hm.2 鉀肥；K300施用300 kg/hm.2 鉀肥，鉀肥為K2O。氮和磷的施用量為氮肥100 kg/hm.2、磷肥P2O5 75 kg/hm.2。每個處理小區(qū)面積為64 m.2，設(shè)置3個重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。田間管理參照當(dāng)?shù)責(zé)煵菰耘嗌a(chǎn)技術(shù)。
1.3 測定項目及方法
在調(diào)查煙草青枯病時，采取以下病害的分級方法：0級，煙草無病斑；1級，煙草莖部偶有褪色病斑，或有條斑一側(cè)有少數(shù)葉片凋萎；2級，莖部有黑色條斑，但尚未達(dá)到煙草頂部，或發(fā)病一側(cè)有1/2以上葉片萎蔫；3級，煙草莖部的黑色條斑達(dá)到植株頂部，或病側(cè)有2/3以上葉片凋萎；4級，植株基本枯死[12]。病情指數(shù)的計算方法：（∑各級數(shù)×該級株數(shù)）/（最高等級數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）×100[13]。每個處理取5個點進(jìn)行調(diào)查，每個點選取10株，一共調(diào)查50株煙草，逐一記載煙草病害分級。調(diào)查完煙草青枯病后，采集煙草植株進(jìn)行各指標(biāo)檢測，主要包括整株生物量、鉀和總酚含量，每個指標(biāo)為3次生物學(xué)重復(fù)。同時將煙草青枯病發(fā)病植株帶回實驗室進(jìn)行病害鑒定，以確定病原菌為Ralstonia solanacearum。 同時采集煙草根際土樣品，每個處理隨機(jī)選取5株進(jìn)行根際土收集，將樣品保存于4 ℃冰箱，測定土壤中青枯病病原菌的數(shù)量，在SMSA培養(yǎng)基上統(tǒng)計病原菌[12]。
指標(biāo)測定方法：將收獲的煙草樣品先在105 ℃下殺青30 min，然后于75 ℃下烘干至恒重后稱重為生物量；將樣品粉碎，利用H2SO4-H2O2進(jìn)行消煮，用火焰光度計法測定植株的鉀濃度；總酚含量測定：取1 g樣品，加入5 mL含有1% HCl的甲醇溶液，提取24 h，取0.1 mL提取液稀釋，定容至5 mL搖勻，用分光光度計測280 nm處OD值為總酚含量。SMSA培養(yǎng)基用于根際土壤中煙草青枯病原菌數(shù)量的測定[12]。
煙草根系分泌物的收集及鑒定：煙草種植30 d后將其從田間取出，用滅菌水清洗煙草根系，然后放入1 000 mL塑料杯中置入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)24 h（16 h光/8 h黑暗），將塑料杯中的液體在冷凍干燥機(jī)中凍干待用，用于測定分泌物中的酚酸，每個處理3次重復(fù)。依據(jù)Ling等[14]的方法，采用高效液相色譜（HPLC，Agilent 1200，USA）進(jìn)行酚酸測定，通過外標(biāo)法計算出各酚酸在根系分泌物中的組成和含量。依據(jù)HPLC的結(jié)果，配制根系分泌物中的3種酚酸溶液，分別配制成酚酸含量為0、100、200、400、600 mg/L的培養(yǎng)基，測定3種酚酸溶液對病原菌生長的影響[12]。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
用Excel 2016 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SAS9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 田間不同鉀肥施用量對煙草青枯病發(fā)病的影響
施鉀肥能顯著降低煙草青枯病害的發(fā)生（表1）。當(dāng)施鉀量為K150（150 kg/hm.2）時，發(fā)病率和病情指數(shù)最低，K225（225 kg/hm.2）處理次之，無鉀肥處理K0（0 kg/hm.2 ）最高。K150處理較K75（75 kg /hm.2）和K0（0 kg /hm.2）處理的發(fā)病率分別降低了24%和31%，病情指數(shù)分別降低了20%和32%，但是施鉀量為K300（300 kg/hm.2）時，其發(fā)病程度反而比K150處理增加。在煙草土壤根際土中的青枯病病原菌含量上，K150處理的病原菌含量是最少的，分別比K0和K75降低了32%和11%，K0處理中青枯病病原菌含量最高。說明施鉀能顯著降低煙草青枯病害的發(fā)生，同時減少了病原菌在根際土壤中的含量，但并不是鉀肥施用越多，其發(fā)病程度就越低。
2.2 田間不同鉀肥施用量對煙草生物性狀的影響
施鉀顯著提高了煙草的生物量、鉀濃度和總酚含量（表2）。煙草的生物量表現(xiàn)為K225最高，K300次之，K0最差。K225處理的煙草生物量分別比K0和K75處理顯著提高了94%和57%，但是K150與K225和K300處理之間生物量沒有顯著性差異，說明需要適量施用鉀肥，并不是鉀肥施用量越大，其生物量就越高。在植株的鉀濃度和總酚含量的指標(biāo)上，鉀肥施用量越多，植株鉀濃度越高。K300處理的鉀濃度分別比K0和K75提高了60%和23%。在總酚含量上可看出，K150處理的總酚含量最高，但是與K225和K300處理之間差異不顯著，但這3個處理的總酚含量均顯著高于K0和K75處理。
2.3 田間不同鉀肥施用量對煙草根系分泌物中酚酸含量的影響
鉀水平顯著改變了煙草根系分泌物中酚酸的含量（表3）。在肉桂酸含量上，K150處理含量是最高的，K225處理次之，K0含量最少。例如，K150處理的肉桂酸含量分別比K0和K75處理顯著提高了3.75和1.53倍。雖然K300處理的施鉀肥量是最高的，但與K150處理相比，還顯著降低了肉桂酸的分泌量。在水楊酸含量上，K150處理含量是最高的，但是K225和K300處理的含量與K150差異不顯著，且均顯著高于K0和K75處理的水楊酸含量，K150處理分別比K0和K75處理顯著提高了1.71和0.72倍。在苯丙酸含量上，K150處理也是最高的，K225處理次之，K0含量最少。K150分別比K0和K75處理顯著提高了2.96和1.73倍。說明在田間施用不同量的鉀肥，能顯著調(diào)控?zé)煵莞捣置谖镏械姆铀岷?，在K150處理中，肉桂酸、水楊酸和苯丙酸的含量均是最高的，K0處理最低。
2.4 添加不同濃度和種類酚酸對煙草青枯病病原菌菌絲干重的影響
由表4可知，添加不同濃度的酚酸對煙草青枯病病原菌菌絲干重有顯著的影響，均表現(xiàn)為低濃度的酚酸能促進(jìn)病原菌的生長，當(dāng)濃度高于400 mg/L時，表現(xiàn)為抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)600 mg/L時，有顯著的抑制效果。在肉桂酸上，當(dāng)濃度為200 mg/L時，煙草青枯病病原菌菌絲干重較0 mg/L處理顯著提高了10%，但比濃度為600 mg/L時的抑制效果顯著降低了25%。水楊酸和苯丙酸也有相同的趨勢，當(dāng)濃度為600 mg/L時抑制效果最明顯。
3 討論與結(jié)論
該研究證明了在田間中施用適量的鉀肥（150 kg/hm.2），能顯著降低煙草青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)，同時病原菌在根際土壤中含量最少。相對于其他的施鉀肥處理，K150處理的煙草青枯病發(fā)病程度最低，其主要是由于施鉀增加了煙草的生物量，提高了植株的鉀濃度，以及與抗病相關(guān)的總酚含量。同時，施鉀調(diào)控了煙草根系分泌物中酚酸物質(zhì)的含量，K150處理顯著增加了肉桂酸、水楊酸和苯丙酸含量，測定酚酸對煙草青枯病病原菌的影響時，表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)菌絲生長，而高濃度抑制。當(dāng)施鉀量超過150 kg/hm.2時，并沒有顯著降低煙草青枯病的發(fā)生，反而有增加的趨勢，根系分泌物中的酚酸含量也有所降低，這表明在田間施用鉀肥，應(yīng)該按照作物所需供肥，實現(xiàn)植株生物量和抵抗病害的利益最大化。
鉀元素具有提高植物抗逆境脅迫的功能，當(dāng)植物受到病原物侵染時，可通過調(diào)節(jié)酚類代謝抵御病原菌的侵害，從而提高植物的抗病性[6-9，11，15]。該研究發(fā)現(xiàn)，施鉀肥能顯著提高煙草對青枯病害的抵抗，施鉀肥后通過提高植株中的總酚含量，降低了煙草青枯病的發(fā)病程度。這與前人的研究報道相似，噴施鉀肥提高了小麥葉片中酚類物質(zhì)含量，從而增強(qiáng)了小麥對白粉病的抵抗能力[16]；施鉀提高了棉花中棉酚含量，而棉酚含量的提高則降低了黃萎病害的發(fā)生[17]。同時，該研究發(fā)現(xiàn)田間施鉀可顯著增加煙草鉀濃度，鉀濃度提高，可增加植物細(xì)胞壁的厚度，能在物理屏障上抵御病原菌的入侵[9，11]。在煙草根際中，K150處理的病原菌含量最少，這主要是由于施鉀調(diào)控了煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)，酚類物質(zhì)的種類和濃度對根際土壤微生物的分布具有一定的影響，能促進(jìn)或抑制土傳病原菌的繁殖，改變植物的根際微環(huán)境[13-15]。
根系分泌物中的酚酸是重要的化感物質(zhì)，已有多種酚酸被證明能顯著抑制病原菌的生長和繁殖[13-15]，這些酚酸物質(zhì)可以通過HPLC、GC/MS等儀器進(jìn)行分離鑒定。該研究通過HPLC鑒定出3種酚酸類物質(zhì)，分別為肉桂酸、水楊酸和苯丙酸，并通過研究其對煙草青枯病病原菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)3種酚酸均呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)病原菌生長，高濃度抑制的效果。這結(jié)果與譚秀梅等[18]研究結(jié)果是相似的。同時，Gao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源添加濃度為40 mg/L的肉桂酸時，能顯著抑制大豆紅冠根腐病病原菌的生長和產(chǎn)孢。Hao等[19]發(fā)現(xiàn)水楊酸顯著促進(jìn)西瓜枯萎病病原菌孢子的萌發(fā)，但濃度達(dá)80 mg/L時卻抑制了孢子的萌發(fā)，其抑制率可達(dá)65%。此外，水楊酸被認(rèn)為是植物抗性通路中的重要物質(zhì)，能提高植物對病原菌的抗性[19-20]。因此，可以推斷煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)是抑制煙草青枯病發(fā)生的化感物質(zhì)之一。同時，施鉀提高作物對病害抗性的機(jī)制，并不是改變根系分泌物這一條途經(jīng)，鉀對防治煙草病害的抗性機(jī)理有待深入探討。
研究表明，在田間鉀肥施用量為150 kg/hm.2時，能有效地降低煙草青枯病的發(fā)病程度，提高植株的生物量、鉀濃度和總酚含量；也能增加根系分泌物中的肉桂酸、水楊酸和苯丙酸濃度，這些酚酸在濃度為600 mg/L時能顯著抑制煙草青枯病病原菌的生長。該研究為施鉀在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治煙草青枯病的發(fā)生提供了簡單可行的策略和理論依據(jù)。
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關(guān)鍵詞 煙草青枯??；鉀肥；發(fā)病率；酚酸
中圖分類號 S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0118-03
Abstract [Objective]To study the regulation on control of tobacco bacterial wilt and phenolic acid release from tobacco roots by application of potassium fertilizer.[Method] The effect of different amount of potassium fertilizer on tobacco bacterial wilt was studied by field experiments， and the inhibitory effect of the pathogen of Ralstonia solanacearum on phenolic acids from root exudates was determined. [Result]When the application of potassium fertilizer was 150 kg/hm.2 in field trial， the incidence and index of tobacco bacterial wilt were the lowest， the number of R. solanacearum in rhizosphere soil was least， which was 5.6 log CFU/g， but no potassium treatment was the worst. Meanwhile， analysis of phenolic acids showed that the 150 kg/hm.2 treatment had the highest amount of cinnamic acid， salicylic acid and phenylpropionic acid from tobacco root exudates. Exogenous phenolic acids added to affect the growth on the pathogen of R. solanacearum showed that low concentration promoted the growth， and the inhibitory effect was achieved when the concentration reached 600 mg/L. In addition， potassium application were significantly increased tobacco biomass， potassium concentration and total phenol content in field trial. [Conclusion]The application of 150 kg/hm.2 potassium fertilizer could effectively control tobacco bacterial wilt in field trial， and the phenolic acids from root exudates could significantly inhibit the growth of R. solanacearum.
Key words Tobacco bacterial wilt；Potassium fertilizer；Disease incidence；Phenolic acids
煙草（Nicotiana tabacum L）是茄科煙草屬經(jīng)濟(jì)作物，在我國主要種植于長江流域和西南地區(qū) [1-2]。處于我國西部地區(qū)的貴州省由于具有優(yōu)越的土地資源和水利條件，因此適宜煙草種植[2-3]，但長期連續(xù)種植煙草，以及氣溫高和空氣濕度大等環(huán)境因素，導(dǎo)致煙草病害發(fā)生嚴(yán)重，特別是難以防治的土傳病害，容易造成煙草產(chǎn)量和品質(zhì)下降[3-4]。煙草青枯病是一種危害嚴(yán)重的土傳維管束病害，由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起，發(fā)病后煙草葉片支脈間出現(xiàn)黑色的斑紋，根系變黑腐爛，最終整棵植株葉片枯萎[4]。使用化學(xué)農(nóng)藥雖然能控制病害的發(fā)生和傳播，但是過量使用農(nóng)藥不但造成煙葉品質(zhì)下降，還容易造成環(huán)境污染問題[4-5]。利用科學(xué)的施肥策略防控病害發(fā)生，對提高煙草產(chǎn)量和品質(zhì)，以及維持煙草產(chǎn)業(yè)的持續(xù)性發(fā)展，具有重要的理論和實踐意義。
鉀是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一，其參與植物生理過程中的各種生化反應(yīng)，還能增強(qiáng)植物在病蟲害、干旱、鹽害等脅迫下的抗逆能力[6-7]，也能調(diào)控植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（例如酚類）抵抗病原菌的侵染[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，施鉀肥能有效抑制檸檬流膠病、玉米莖腐病、山茱萸炭疽病和油菜黑斑病的發(fā)生[6-9]。目前關(guān)于鉀對植物的抗性機(jī)理研究主要在地上部分，而地下部根系是植物吸收營養(yǎng)和水分的主要器官[9-10]。根系分泌物能為土壤微生物提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)，且分泌物中的酚酸物質(zhì)與連作障礙有密切的關(guān)系[10-11]。筆者在前人研究基礎(chǔ)上，通過設(shè)置田間試驗，研究不同施鉀肥水平對煙草青枯病的防控效果，鑒定煙草根系分泌物中酚酸的種類和含量，并測定這些酚酸對抑制煙草青枯病病原菌生長的影響。
1 材料與方法
1.1 試驗地及材料
試驗于2017年在貴州省畢節(jié)地區(qū)煙草種植試驗地進(jìn)行，土壤基本理化性質(zhì)：pH 5.5，有機(jī)質(zhì)12.3 g/kg、速效氮114.8 mg/kg、速效磷13.9 mg/kg、速效鉀98.2 mg/kg。煙草移栽時間為2017年4月13日，煙草青枯病調(diào)查時間為7月8日。選用煙草品種為青枯病敏感品種DJY。
1.2 試驗方法
田間試驗設(shè)置5個處理，分別為K0無鉀肥；K75施用75 kg/hm.2 鉀肥；K150施用150 kg/hm.2 鉀肥；K225 施用225 kg/hm.2 鉀肥；K300施用300 kg/hm.2 鉀肥，鉀肥為K2O。氮和磷的施用量為氮肥100 kg/hm.2、磷肥P2O5 75 kg/hm.2。每個處理小區(qū)面積為64 m.2，設(shè)置3個重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。田間管理參照當(dāng)?shù)責(zé)煵菰耘嗌a(chǎn)技術(shù)。
1.3 測定項目及方法
在調(diào)查煙草青枯病時，采取以下病害的分級方法：0級，煙草無病斑；1級，煙草莖部偶有褪色病斑，或有條斑一側(cè)有少數(shù)葉片凋萎；2級，莖部有黑色條斑，但尚未達(dá)到煙草頂部，或發(fā)病一側(cè)有1/2以上葉片萎蔫；3級，煙草莖部的黑色條斑達(dá)到植株頂部，或病側(cè)有2/3以上葉片凋萎；4級，植株基本枯死[12]。病情指數(shù)的計算方法：（∑各級數(shù)×該級株數(shù)）/（最高等級數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）×100[13]。每個處理取5個點進(jìn)行調(diào)查，每個點選取10株，一共調(diào)查50株煙草，逐一記載煙草病害分級。調(diào)查完煙草青枯病后，采集煙草植株進(jìn)行各指標(biāo)檢測，主要包括整株生物量、鉀和總酚含量，每個指標(biāo)為3次生物學(xué)重復(fù)。同時將煙草青枯病發(fā)病植株帶回實驗室進(jìn)行病害鑒定，以確定病原菌為Ralstonia solanacearum。 同時采集煙草根際土樣品，每個處理隨機(jī)選取5株進(jìn)行根際土收集，將樣品保存于4 ℃冰箱，測定土壤中青枯病病原菌的數(shù)量，在SMSA培養(yǎng)基上統(tǒng)計病原菌[12]。
指標(biāo)測定方法：將收獲的煙草樣品先在105 ℃下殺青30 min，然后于75 ℃下烘干至恒重后稱重為生物量；將樣品粉碎，利用H2SO4-H2O2進(jìn)行消煮，用火焰光度計法測定植株的鉀濃度；總酚含量測定：取1 g樣品，加入5 mL含有1% HCl的甲醇溶液，提取24 h，取0.1 mL提取液稀釋，定容至5 mL搖勻，用分光光度計測280 nm處OD值為總酚含量。SMSA培養(yǎng)基用于根際土壤中煙草青枯病原菌數(shù)量的測定[12]。
煙草根系分泌物的收集及鑒定：煙草種植30 d后將其從田間取出，用滅菌水清洗煙草根系，然后放入1 000 mL塑料杯中置入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)24 h（16 h光/8 h黑暗），將塑料杯中的液體在冷凍干燥機(jī)中凍干待用，用于測定分泌物中的酚酸，每個處理3次重復(fù)。依據(jù)Ling等[14]的方法，采用高效液相色譜（HPLC，Agilent 1200，USA）進(jìn)行酚酸測定，通過外標(biāo)法計算出各酚酸在根系分泌物中的組成和含量。依據(jù)HPLC的結(jié)果，配制根系分泌物中的3種酚酸溶液，分別配制成酚酸含量為0、100、200、400、600 mg/L的培養(yǎng)基，測定3種酚酸溶液對病原菌生長的影響[12]。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
用Excel 2016 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SAS9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 田間不同鉀肥施用量對煙草青枯病發(fā)病的影響
施鉀肥能顯著降低煙草青枯病害的發(fā)生（表1）。當(dāng)施鉀量為K150（150 kg/hm.2）時，發(fā)病率和病情指數(shù)最低，K225（225 kg/hm.2）處理次之，無鉀肥處理K0（0 kg/hm.2 ）最高。K150處理較K75（75 kg /hm.2）和K0（0 kg /hm.2）處理的發(fā)病率分別降低了24%和31%，病情指數(shù)分別降低了20%和32%，但是施鉀量為K300（300 kg/hm.2）時，其發(fā)病程度反而比K150處理增加。在煙草土壤根際土中的青枯病病原菌含量上，K150處理的病原菌含量是最少的，分別比K0和K75降低了32%和11%，K0處理中青枯病病原菌含量最高。說明施鉀能顯著降低煙草青枯病害的發(fā)生，同時減少了病原菌在根際土壤中的含量，但并不是鉀肥施用越多，其發(fā)病程度就越低。
2.2 田間不同鉀肥施用量對煙草生物性狀的影響
施鉀顯著提高了煙草的生物量、鉀濃度和總酚含量（表2）。煙草的生物量表現(xiàn)為K225最高，K300次之，K0最差。K225處理的煙草生物量分別比K0和K75處理顯著提高了94%和57%，但是K150與K225和K300處理之間生物量沒有顯著性差異，說明需要適量施用鉀肥，并不是鉀肥施用量越大，其生物量就越高。在植株的鉀濃度和總酚含量的指標(biāo)上，鉀肥施用量越多，植株鉀濃度越高。K300處理的鉀濃度分別比K0和K75提高了60%和23%。在總酚含量上可看出，K150處理的總酚含量最高，但是與K225和K300處理之間差異不顯著，但這3個處理的總酚含量均顯著高于K0和K75處理。
2.3 田間不同鉀肥施用量對煙草根系分泌物中酚酸含量的影響
鉀水平顯著改變了煙草根系分泌物中酚酸的含量（表3）。在肉桂酸含量上，K150處理含量是最高的，K225處理次之，K0含量最少。例如，K150處理的肉桂酸含量分別比K0和K75處理顯著提高了3.75和1.53倍。雖然K300處理的施鉀肥量是最高的，但與K150處理相比，還顯著降低了肉桂酸的分泌量。在水楊酸含量上，K150處理含量是最高的，但是K225和K300處理的含量與K150差異不顯著，且均顯著高于K0和K75處理的水楊酸含量，K150處理分別比K0和K75處理顯著提高了1.71和0.72倍。在苯丙酸含量上，K150處理也是最高的，K225處理次之，K0含量最少。K150分別比K0和K75處理顯著提高了2.96和1.73倍。說明在田間施用不同量的鉀肥，能顯著調(diào)控?zé)煵莞捣置谖镏械姆铀岷?，在K150處理中，肉桂酸、水楊酸和苯丙酸的含量均是最高的，K0處理最低。
2.4 添加不同濃度和種類酚酸對煙草青枯病病原菌菌絲干重的影響
由表4可知，添加不同濃度的酚酸對煙草青枯病病原菌菌絲干重有顯著的影響，均表現(xiàn)為低濃度的酚酸能促進(jìn)病原菌的生長，當(dāng)濃度高于400 mg/L時，表現(xiàn)為抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)600 mg/L時，有顯著的抑制效果。在肉桂酸上，當(dāng)濃度為200 mg/L時，煙草青枯病病原菌菌絲干重較0 mg/L處理顯著提高了10%，但比濃度為600 mg/L時的抑制效果顯著降低了25%。水楊酸和苯丙酸也有相同的趨勢，當(dāng)濃度為600 mg/L時抑制效果最明顯。
3 討論與結(jié)論
該研究證明了在田間中施用適量的鉀肥（150 kg/hm.2），能顯著降低煙草青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)，同時病原菌在根際土壤中含量最少。相對于其他的施鉀肥處理，K150處理的煙草青枯病發(fā)病程度最低，其主要是由于施鉀增加了煙草的生物量，提高了植株的鉀濃度，以及與抗病相關(guān)的總酚含量。同時，施鉀調(diào)控了煙草根系分泌物中酚酸物質(zhì)的含量，K150處理顯著增加了肉桂酸、水楊酸和苯丙酸含量，測定酚酸對煙草青枯病病原菌的影響時，表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)菌絲生長，而高濃度抑制。當(dāng)施鉀量超過150 kg/hm.2時，并沒有顯著降低煙草青枯病的發(fā)生，反而有增加的趨勢，根系分泌物中的酚酸含量也有所降低，這表明在田間施用鉀肥，應(yīng)該按照作物所需供肥，實現(xiàn)植株生物量和抵抗病害的利益最大化。
鉀元素具有提高植物抗逆境脅迫的功能，當(dāng)植物受到病原物侵染時，可通過調(diào)節(jié)酚類代謝抵御病原菌的侵害，從而提高植物的抗病性[6-9，11，15]。該研究發(fā)現(xiàn)，施鉀肥能顯著提高煙草對青枯病害的抵抗，施鉀肥后通過提高植株中的總酚含量，降低了煙草青枯病的發(fā)病程度。這與前人的研究報道相似，噴施鉀肥提高了小麥葉片中酚類物質(zhì)含量，從而增強(qiáng)了小麥對白粉病的抵抗能力[16]；施鉀提高了棉花中棉酚含量，而棉酚含量的提高則降低了黃萎病害的發(fā)生[17]。同時，該研究發(fā)現(xiàn)田間施鉀可顯著增加煙草鉀濃度，鉀濃度提高，可增加植物細(xì)胞壁的厚度，能在物理屏障上抵御病原菌的入侵[9，11]。在煙草根際中，K150處理的病原菌含量最少，這主要是由于施鉀調(diào)控了煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)，酚類物質(zhì)的種類和濃度對根際土壤微生物的分布具有一定的影響，能促進(jìn)或抑制土傳病原菌的繁殖，改變植物的根際微環(huán)境[13-15]。
根系分泌物中的酚酸是重要的化感物質(zhì)，已有多種酚酸被證明能顯著抑制病原菌的生長和繁殖[13-15]，這些酚酸物質(zhì)可以通過HPLC、GC/MS等儀器進(jìn)行分離鑒定。該研究通過HPLC鑒定出3種酚酸類物質(zhì)，分別為肉桂酸、水楊酸和苯丙酸，并通過研究其對煙草青枯病病原菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)3種酚酸均呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)病原菌生長，高濃度抑制的效果。這結(jié)果與譚秀梅等[18]研究結(jié)果是相似的。同時，Gao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源添加濃度為40 mg/L的肉桂酸時，能顯著抑制大豆紅冠根腐病病原菌的生長和產(chǎn)孢。Hao等[19]發(fā)現(xiàn)水楊酸顯著促進(jìn)西瓜枯萎病病原菌孢子的萌發(fā)，但濃度達(dá)80 mg/L時卻抑制了孢子的萌發(fā)，其抑制率可達(dá)65%。此外，水楊酸被認(rèn)為是植物抗性通路中的重要物質(zhì)，能提高植物對病原菌的抗性[19-20]。因此，可以推斷煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)是抑制煙草青枯病發(fā)生的化感物質(zhì)之一。同時，施鉀提高作物對病害抗性的機(jī)制，并不是改變根系分泌物這一條途經(jīng)，鉀對防治煙草病害的抗性機(jī)理有待深入探討。
研究表明，在田間鉀肥施用量為150 kg/hm.2時，能有效地降低煙草青枯病的發(fā)病程度，提高植株的生物量、鉀濃度和總酚含量；也能增加根系分泌物中的肉桂酸、水楊酸和苯丙酸濃度，這些酚酸在濃度為600 mg/L時能顯著抑制煙草青枯病病原菌的生長。該研究為施鉀在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治煙草青枯病的發(fā)生提供了簡單可行的策略和理論依據(jù)。
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