熒光定量PCR技術(shù)的原理及其在植物研究中的應(yīng)用

黃小玲　張登　廖嘉明

摘要實時熒光定量PCR技術(shù)，因其具有操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、速度快等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的多個領(lǐng)域。對實時熒光定量PCR技術(shù)的原理、定量方法以及在植物研究中的應(yīng)用等進(jìn)行概述，以促進(jìn)該技術(shù)的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞實時熒光定量PCR；原理；應(yīng)用

中圖分類號S126文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0036-05

Principles and Applications of Fluorescent Quantitative PCR in Plant Research

HUANG Xiaoling， ZHANG Deng， LIAO Jiaming et al

（Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm， College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agriculture University， Guangzhou，Guangdong 510642）

AbstractRealtime fluorescence quantitative PCR technology has been widely used in many fields of molecular biology research due to its advantages of simple operation， good repeatability， high sensitivity， accurate quantitation and high speed. Principle，quantitative methods and applications in plant research of realtime fluorescence quantitative PCR technology were reviewed to promote its application.

Key wordsRealtime quantitative PCR；Principles；Application

自從1985年Saiki等[1]發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）以來，PCR技術(shù)很快成為科研、臨床診斷的熱點技術(shù)。但傳統(tǒng)PCR技術(shù)在應(yīng)用中一是不能準(zhǔn)確定量，二是容易交叉污染，產(chǎn)生假陽性。直到1992年，日本Higuchi等[2]首次采用動態(tài)PCR方法和封閉式檢測方式對目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，首次提出熒光定量PCR技術(shù)的概念。當(dāng)時他使用EB（溴化乙錠）作為熒光標(biāo)記染料，采用一臺經(jīng)過改良的熱循環(huán)儀，用UV射線照射樣品，然后通過CCD相機檢測產(chǎn)生的熒光值，利用PCR反應(yīng)中的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，再結(jié)合加入標(biāo)準(zhǔn)品的方法，達(dá)到對檢測樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量的目的。但由于這種方法實驗儀器昂貴，一些非特異的PCR產(chǎn)物同樣能被檢測到并包含在被測的熒光信號值總量之中而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確等因素，最終使這種試驗技術(shù)在當(dāng)時沒能成為主流的試驗技術(shù)。

1995年美國PE公司成功研制TaqMan技術(shù)，1996年又推出首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過檢測每個循環(huán)的熒光強度，并使用Ct值進(jìn)行分析，熒光定量PCR才很快得到大家的接受，并廣為應(yīng)用。

1RT-qPCR技術(shù)的原理

實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，從而實現(xiàn)對起始模板的定量及定性分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可分為3個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。該技術(shù)不僅實現(xiàn)對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染性、實時性和準(zhǔn)確性等特點，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[3-6]。

2RT-qPCR的分類

熒光定量PCR使用的熒光化學(xué)可分為2種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量PCR的方法相應(yīng)的可分為特異類和非特異類2類，特異性檢測方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物；而非特異性檢測方法是在PCR反應(yīng)體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號。前者由于增加探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行，并且價格較低。

2.1SYBR Green Ⅰ

SYBR Green Ⅰ 是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強。SYBR Green Ⅰ 的最大吸收波長約為497 nm，發(fā)射波長最大約為520 nm。由于SYBR Green Ⅰ沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光，對PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。但它能與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對不同模板不需要特別定制不同的特異的探針，通用性較好，并且價格相對較低，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。

2.2水解探針（Taqman）

Taqman探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5末端，而淬滅劑則在3末端。當(dāng)探針與靶序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3端的淬滅劑接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此，Taqman探針檢測的是積累熒光。

2.3雜交探針（Beacon、FRET）

分子信標(biāo)（molecular beacon）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標(biāo)的頸環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15～30個核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補：頸一般為5～7個核苷酸長，并互相配對形成頸的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因為模板不存在時形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會互補配對的頸環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在，環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光。由于是酶切作用的存在，分子信標(biāo)也是積累熒光。常用的熒光基團(tuán)有FAM和Texas Red。

FRET探針又稱雙雜交探針，F(xiàn)RET探針由2條相鄰探針組成，當(dāng)退火時，在一條探針的5端標(biāo)記FAM和在另一條探針的3端標(biāo)記Red640基團(tuán)相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光，作為Red640基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使Red640發(fā)出波長為640 nm的熒光。當(dāng)變性時，探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生640 nm波長的熒光。由于FRET探針是靠近發(fā)光，所以檢測信號是實時信號，非積累信號。常用的熒光基團(tuán)有LC-Red640、LC-Red705。

3RT-qPCR的定量方法

在實時熒光PCR中，模板的定量有2種方法：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定我們所感興趣基因的拷貝數(shù)；相對定量指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化。

3.1絕對定量

絕對定量RT-qPCR一般采用外標(biāo)準(zhǔn)品定量的制備來實現(xiàn)絕對定量。而標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類有含有與待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒、含有與待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA或PCR的產(chǎn)物。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的樣品，并作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對未知樣品進(jìn)行定量時，根據(jù)未知樣品的ct值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中定出樣品的拷貝數(shù)。絕對定量具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確等優(yōu)點，因此在很多文獻(xiàn)中已有報道[7-11]。

3.2相對定量

相對定量是指在測定目的基因的同時測定某一內(nèi)源性管家基因，采用靶基因與內(nèi)源對照基因的表達(dá)比值來標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果[12-14]。在定量PCR中，為了去除不同樣本在RNA產(chǎn)量、質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異，通常選擇內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[15-19]。定量PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性在很大程度上取決于穩(wěn)定內(nèi)參基因的選擇。目前，Vandesompele等[20]、Andersen等[21]、Pfaff1等[22]分別編寫GeNorm、NormFinder和BestKeeper程序用于比較內(nèi)參基因的表達(dá)變化和穩(wěn)定性，并且GeNorm程序得到進(jìn)一步改進(jìn)[23]。

4MIQE指導(dǎo)方針

目前，對如何更好地進(jìn)行和解釋定量PCR試驗缺少一致的意見。且由于缺少足夠的試驗細(xì)節(jié)描述而進(jìn)一步惡化，從而妨礙讀者對試驗結(jié)果的精密評價和試驗的重復(fù)。因此，Bustin等[24]于2009年提出MIQE指導(dǎo)方針（The Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments，MIQE）。MIQE是一套評估定量PCR試驗描述的最低需要的指導(dǎo)方針，包括樣品的獲取、試驗設(shè)計驗證以及數(shù)據(jù)分析等方面。MIQE指導(dǎo)方針旨在于為試驗結(jié)果提供可靠性，從而確?？茖W(xué)文獻(xiàn)的真實性、促進(jìn)實驗室之間的一致性以及提高試驗的透明度。非定量PCR專業(yè)人士對于MIQE指導(dǎo)方針眾多試驗關(guān)聯(lián)細(xì)節(jié)的詳盡描述感到繁瑣和畏懼，使得已建立的試驗常規(guī)報告變得復(fù)雜。為此，Bustin等[25]于2010年提出一套簡約版的指導(dǎo)方針——MIQE概要，覆蓋每個定量PCR試驗的主要參數(shù)。按照MIQE的指導(dǎo)方針，完全公布試驗試劑、序列以及數(shù)據(jù)分析方法能更好地使其他研究者重現(xiàn)試驗結(jié)果[24]。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2018年

5實時熒光定量PCR在植物研究中的應(yīng)用

定量RT-PCR技術(shù)主要用于基因表達(dá)的定性和定量檢測，其自問世以來在基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域取得較大的成績[26]。雖然在植物研究方面應(yīng)用起步較晚，但目前在植物學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛，如植物營養(yǎng)學(xué)研究、植物發(fā)育學(xué)研究、植物抗逆機理研究、轉(zhuǎn)基因植物的檢測、病原菌的檢測、植物與微生物互作機理研究、植物抗病性檢測、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境對植物基因表達(dá)的影響等方面[27]。

5.1基因差異表達(dá)分析

植物的生長、發(fā)育、分化和衰老涉及許多基因的時空順序表達(dá)，因此，研究這個過程中基因表達(dá)的變化是揭示生長發(fā)育機理的重要手段。RT-qPCR技術(shù)是研究植物基因表達(dá)水平變化的一項重要技術(shù)[27]。Farzad等[28]利用RT-qPCR技術(shù)研究角堇（Viola cornuta cv.）的3個花青苷生物合成基因查爾酮合酶基因（CHS）、二氫黃酮醇4-還原酶基因（DFR）和花色素合酶基因（ANS）在花的3個不同發(fā)育時期的表達(dá)差異，并且把角堇確立為研究自然條件下基因調(diào)控花顏色改變的新模式系統(tǒng)。Harada等[29]在康乃馨開花的過程中，研究與花瓣的生長和發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，熒光定量分析顯示4個木葡聚糖內(nèi)傳糖苷酶/水解酶基因XTH（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）和3個擴(kuò)展蛋白基因EXP（expansin，EXP）在康乃馨的綠色營養(yǎng)器官、花瓣、柱頭以及花柱的不同部位存在差異表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)在不同的發(fā)育時期，這7個基因在花瓣中的表達(dá)也有差異。結(jié)果表明DcXTH2、DcXTH3、DcEXPA1和DcEXPA2在康乃馨花開放的過程中與花瓣的生長發(fā)育有關(guān)。Wang等[30]利用熒光定量PCR研究EXP基因在杉木各個不同部位的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ClEXPA1、ClEXPA2 2個基因在形成層中存在特異表達(dá)，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因煙草研究，表明這2個基因通過直接或間接影響纖維素的新陳代謝參與植物的生長發(fā)育。

5.2植物病理學(xué)研究

植物抗病性及其機制研究一直是當(dāng)今植物病理學(xué)和植物抗病育種中的熱點和焦點問題[31]。RT-qPCR技術(shù)可以用于研究病原菌感染宿主植物的過程中，宿主植物基因表達(dá)的改變以及抗病植株與感病植株的基因表達(dá)的差異，為植物抗病機理的研究和抗病品種的選育提供理論依據(jù)[27]。到目前為止，RT-qPCR技術(shù)已在水稻[32-34]、玉米[35-37]、小麥[38-39]、大麥[40-42]、大豆[43]、豌豆[44]、黃瓜[45]、橙[46]、花生[47]、油菜[48]、葡萄[49]、蘋果[50]、辣椒[51]、楊樹[52]、云杉[53]等植物中廣泛應(yīng)用。

5.3外源基因拷貝數(shù)分析

植物轉(zhuǎn)基因研究中，外源基因在植物基因組中的拷貝數(shù)為1～2個時能夠較好表達(dá)，插入拷貝數(shù)較多時會導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定，甚至發(fā)生基因沉默現(xiàn)象[54]。因此，T0代轉(zhuǎn)基因外源基因的拷貝數(shù)是研究植物轉(zhuǎn)基因分子特性的基礎(chǔ)步驟之一[26]。Southern-blot方法是鑒定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的傳統(tǒng)方法，但其具有操作繁瑣、試劑昂貴、樣品需要量大等缺點，使得研究人員消耗太多的人力、物力。實時定量PCR法克服了Southern blot的定量缺點，已被廣泛應(yīng)用于DNA的定量檢測。Mason等[55]利用TaqMAN探針熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因番茄的目的基因的1、2、3拷貝數(shù)，并且與通過Southern blot分析所得的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者所獲信息的質(zhì)量比后者更高。Yi等[56]利用熒光定量PCR技術(shù)，以單拷貝基因GhUBC1為內(nèi)參，對轉(zhuǎn)基因棉花的28個T0代株系的拷貝數(shù)進(jìn)行成功檢測，并且有效地從T1代的轉(zhuǎn)基因群體中鑒定出純合子。然而，由于轉(zhuǎn)基因常常伴隨著嵌合體的出現(xiàn)[57-58]，而熒光定量PCR技術(shù)也可用于嵌合體的檢測[59]。

5.4植物病菌、病原微生物及害蟲檢測

植物病菌或病原微生物常常能引起多種農(nóng)作物、園林觀賞、經(jīng)濟(jì)作物及牧草發(fā)生病害。傳統(tǒng)的檢測方法主要是采用生物學(xué)和血清學(xué)方法，費時又費力。自從實時熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于植物病菌的檢測之后，不僅有效地提高檢測速度和水平，而且檢測的靈敏度也比一般的檢測方法高出100倍左右。還有一個明顯的優(yōu)點是試驗中不需要PCR的后續(xù)處理及病原菌的分離培養(yǎng)，大大簡化試驗操作步驟，縮短檢測時間[60]。自2002年Frederick首次將該方法應(yīng)用于植物病原真菌的檢測[61]，國內(nèi)外已出現(xiàn)大量利用該技術(shù)檢測病原菌的報道[62-67]。

目前，實時定量PCR技術(shù)應(yīng)用于植物害蟲鑒定、防治等研究相對其他領(lǐng)域較少，但該技術(shù)在植物害蟲、植物病原線蟲[68-70]和害螨[71]研究中已經(jīng)顯示出極好的應(yīng)用前景[72]。傳統(tǒng)的植物害蟲鑒定方法依賴于形態(tài)特征和寄主范圍等特征來區(qū)分，但是對于一些植物害蟲之間的區(qū)分比較困難，尤其是檢疫性植物害蟲實蠅類[73]、薊馬類[74-75]等，而實時定量PCR技術(shù)是解決這一問題的可靠手段[72]。

5.5轉(zhuǎn)基因植物鑒定

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品已逐步進(jìn)入普通百姓的生活。轉(zhuǎn)基因食品特別是水稻、小麥、玉米等主要糧食作物的轉(zhuǎn)基因品種往往具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲害的特點[31]。但在解決人類面臨的糧食和能源危機的同時，也帶來新的問題，如生態(tài)問題，轉(zhuǎn)基因食品對人類健康的危害等，因此，對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測和定量是大家關(guān)注的焦點[26]。

熒光定量PCR技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速靈敏檢測的技術(shù)途徑，并被廣泛使用[76-78]。根據(jù)目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)中使用的基因構(gòu)件主要來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子和NOS終止子，絕大部分轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品含有這2個基因片段，用檢測定量這2個片段就可達(dá)到簡便、快速、準(zhǔn)確地確定是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品[79]。

6前景

目前，實時熒光定量PCR技術(shù)還廣泛應(yīng)用于植物營養(yǎng)學(xué)研究、植物發(fā)育學(xué)研究、植物抗逆機理研究、植物與微生物互作機理研究、植物抗病性檢測、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境對植物基因表達(dá)的影響等方面[27]。近年來，許多科研工作者基于熒光PCR的基本原理對熒光PCR技術(shù)進(jìn)行不斷深入地研究和改進(jìn)，使熒光PCR技術(shù)得到進(jìn)一步的完善，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出許多新的熒光定量PCR技術(shù)。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，儀器設(shè)備和試劑費用的降低及相關(guān)知識的普及，RT-qPCR技術(shù)將成為分子生物學(xué)實驗室必備的研究工具，將會廣泛應(yīng)用于植物研究各領(lǐng)域。

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