徐萍　范娟　葉正琴

摘要[目的]開發(fā)和研制鑒別豬圓環(huán)病毒疫苗免疫和野毒感染的ELISA檢測(cè)試劑盒。[方法]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫錄入的2型豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus 2，PCV-2）REP蛋白序列（GenBank登錄號(hào)為KX828581）設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增REP蛋白全長基，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-rep，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，并誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。[結(jié)果]經(jīng)過SDS-PAGE分析，獲得了大小約40 ku的目的蛋白，與理論大小相一致。重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后重組蛋白濃度為40 μg/mL，純度約95%。Western Blot及ELISA鑒定結(jié)果顯示，該重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。[結(jié)論]鑒于該重組蛋白具有良好的免疫原性及反應(yīng)原性，該重組蛋白可為開發(fā)區(qū)分豬圓環(huán)病毒2型疫苗免疫和野毒感染的檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞PCV-2；REP蛋白；原核表達(dá)；免疫原性

中圖分類號(hào)S858.28文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）28-0084-04

Prokaryotic Expression and Immunogenicity Identification of REP Protein of Porcine Circovirus Type 2

XU Ping， FAN Juan， YE Zhengqin et al

（Yangzhou Youbang Biological Pharmaceuticals Co.， Ltd， Yangzhou，Jiangsu 225008）

Abstract[Objective]To develop and produce Elisa kits for distinguishing vaccine immunization of porcine circovirus and wild virus infection. [Method]Based on the REP full length gene sequence of PCV2 （GenBank ID：KX828581）， a pair of specific primers were designed for the amplification of the REP gene sequence. The prokaryotic expression vector pET28arep was constructed， E.coli BL21 （DE3） competent cell was transformed and the expression of recombinant protein was induced. [Result]Through SDSPAGE， target protein with the size of about 40 ku was obtained， which was accordant with the theoretical size. The recombinant protein was purified by using nickel column， and the purified recombinant protein concentration was 40 μg/mL， the purity was about 95%. Western Blot and ELISA results showed that the recombinant protein had good immunogenicity and reactivity. [Conclusion]The recombinant protein could lay the foundation for developing ELISA kits for distinguishing vaccine immunization of PCV2 and wild virus infections.

Key wordsPCV2；REP protein；Prokaryotic expression；Immunogenicity

豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV-2）是近年來危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，可以引發(fā)豬圓環(huán)病毒?。≒CVD），包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道病以及繁殖障礙等[1-2]。PCV-2主要感染5～12周齡豬，造成感染發(fā)病豬生長遲緩、貧血、消瘦、呼吸困難、黃疸；此外，還可引起感染豬的免疫抑制，繼發(fā)多種病毒、細(xì)菌病原混合感染，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。PCV-2屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為無囊膜的DNA病毒，其基因組為1條長約1.76 kb的共價(jià)閉合環(huán)狀單鏈DNA[4]。PCV-2基因組含有3個(gè)主要的開放閱讀框，即ORF1、ORF2和ORF3。ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（REP/REP′）；ORF2編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白（Cap），是誘導(dǎo)免疫保護(hù)的關(guān)鍵抗原；ORF3位于ORF1內(nèi)部，反向編碼，由315個(gè)堿基組成，編碼105個(gè)與病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)的氨基酸[5-6]。研究表明，REP蛋白上也含有特異的抗原表位，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，桿狀病毒表達(dá)的REP蛋白可以起到一定的免疫保護(hù)作用。由于針對(duì)REP蛋白的抗體只在圓環(huán)病毒繁殖階段產(chǎn)生，而市場(chǎng)上目前所售圓環(huán)病毒疫苗皆為全病毒滅活疫苗或基因工程亞單位疫苗。因而，針對(duì)REP蛋白抗體的檢測(cè)是檢測(cè)圓環(huán)病毒疫苗免疫和野毒感染的重要靶點(diǎn)。

筆者通過PCR方法擴(kuò)增1株P(guān)CV-2b型毒株rep基因，克隆入原核表達(dá)載體pET-28a，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種和載體。E.coli TOP10、E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞和pET-28a載體，均購自Invitrogen公司；pMD19-T載體購自TaKaRa公司。

1.1.2病毒和血清。PCV-2b（YZ株）由揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司提供；圓環(huán)抗體陰性豬攻毒后陽性血清（血清A）和圓環(huán)抗體陰性豬疫苗免疫后陽性血清（血清B）由揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司研發(fā)部制備。

1.1.3主要試劑。FastPfu DNA聚合酶、dNTPs、BamH I、Hind Ⅲ、Trans2K plus DNA marker、Blue Plus Protein marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Axygen公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG酶標(biāo)二抗、IPTG均購自Sigma公司；其他試劑為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成。

根據(jù)GenBank公布的PCV-2b序列（登錄號(hào)為KX828581），利用Oligo 7.27設(shè)計(jì)引物，引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

rep-up：CGCGGATCCACCATGCCCAGCAAGAAGAATG。

rep-down：CCCAA GCTTTCAGTAATTTATTTCATATGGAAATTCAGGGC。

1.2.2PCV-2b DNA提取。

按照試劑盒說明書提取PCV-2b DNA。

1.2.3PCV-2b REP蛋白基因擴(kuò)增 。

以“1.2.2”中提取的DNA為模板，以rep-up和rep-down為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：1 μL模板、rep-up和rep-down各1 μL 、10 μL 緩沖液、4 μL dNTPs、1 μL Fastpfu、32 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定片段大小。合適大小的PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒說明進(jìn)行膠回收。

1.2.4PCV-2b REP蛋白基因的克隆與鑒定。

將經(jīng)膠回收的目的片段連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組pMD19-rep。將經(jīng)菌落PCR鑒定正確的單克隆送交金斯瑞公司測(cè)序。

1.2.5原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定。

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD19-rep用BamH I和Hind Ⅲ雙酶切。對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，膠回收目的片段，與采取同樣操作的pET-28a進(jìn)行連接，得到的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-rep。將重組質(zhì)粒pET-28a-rep轉(zhuǎn)入E.coli BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑出陽性克隆進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定，鑒定正確的重組菌命名為BL21/28a-rep。

1.2.6BL21/28a-rep的誘導(dǎo)表達(dá)。

挑取重組菌BL21/28a-rep單菌落接種到LB培養(yǎng)基（卡那霉素終濃度為100 μg/mL）中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600=0.8左右，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)轉(zhuǎn)速為220 r/min。

1.2.7重組蛋白的純化與鑒定。

誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌體，收集到的菌體用PBS緩沖液洗滌2次，并用PBS緩沖液重懸菌體。在冰浴條件下進(jìn)行超聲波裂解菌體，裂解結(jié)束后分別對(duì)裂解上清和沉淀取樣，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。使用鎳柱進(jìn)行重組蛋白的純化，純化步驟如下：細(xì)胞破碎上清在結(jié)合緩沖液中過夜透析，透析液上樣過柱（5 mL HisTrap，GE HealthCare），再用結(jié)合緩沖液洗滌5個(gè)柱體積，最后用洗脫緩沖液洗滌5個(gè)柱體積，收集洗脫組分，并用SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.8Western Blot鑒定。

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)方式進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜緩沖液為Tris 3.0 g、Gly 14.4 g、甲醇200 mL，加去離子水至1 000 mL。轉(zhuǎn)膜完成后用5%脫脂乳封閉，4 ℃下過夜，封閉結(jié)束后用PBST沖洗3遍，加入陽性血清（圓環(huán)病毒抗體陰性豬攻毒后分離）或陽性血清（圓環(huán)病毒抗體陰性豬疫苗免疫后分離）孵育2 h，孵育結(jié)束后用PBST沖洗5遍，加入HRP標(biāo)記羊抗豬IgG孵育1 h，孵育結(jié)束后用PBST沖洗5遍，最后加入沉淀型TMB顯色10～30 min，拍照。

1.2.9間接ELISA方法鑒定重組蛋白。

將純化的REP蛋白作為診斷抗原，用包被液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）將診斷抗原分別稀釋至10.000、5.000、2.500、1.250、0.625 μg/mL，每孔100 μL 包被酶標(biāo)板，4 ℃下過夜。陽性血清和陰性血清用PBST分別稀釋至1∶50、1∶100、1∶200和1∶400，按照常規(guī)方法進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果判定。

2結(jié)果與分析

2.1REP蛋白基因擴(kuò)增

運(yùn)用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增PCV-2b的REP蛋白，擴(kuò)增得到了一條大小約945 bp的目的片段（圖1），與理論片段大小相一致。

2.2pMD19-rep的PCR和酶切鑒定

將重組質(zhì)粒pMD19-rep進(jìn)行PCR鑒定，可以擴(kuò)增出約945 bp的特異性片段，經(jīng)雙酶切鑒定，得到與理論大小一致的片段（圖2）。

2.3REP蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定

采用菌落PCR初步鑒定陽性克隆，再利用雙酶切對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見圖3。

2.4REP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

2.4.1重組蛋白可溶性分析。

重組菌在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG、220 r/min下誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心后收集菌體，超聲波裂解菌體，對(duì)全菌和破碎上清進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。從圖4可以看出，目的蛋白獲得了較好的可溶性表達(dá)。

2.4.2重組蛋白純化。

重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后，用SDS-PAGE蛋白電泳鑒定純化后的表達(dá)產(chǎn)物，在40 ku處得到一個(gè)單一條帶，與理論條帶大小相符，因此該條帶即為REP蛋白（圖5）。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳后，轉(zhuǎn)至NC膜，進(jìn)行Western Blot鑒定，結(jié)果見圖6和7。從Western Blot鑒定結(jié)果（圖6、7）來看，該重組REP蛋白具有較好的特

2.4.3重組蛋白的間接ELISA鑒定。

從表1可以看出，大腸桿菌表達(dá)的重組REP蛋白與PCV-2b攻毒后的陽性血清有較好的反應(yīng)，可作為檢測(cè)圓環(huán)病毒疫苗免疫和野毒感染的診斷抗原。此外，如果要建立間接ELISA方法，抗原包被濃度為5.0 μg/mL、血清稀釋度為1∶50時(shí)，陽性血清OD450 nm約1.0，P/N值最高。

3討論與結(jié)論

豬圓環(huán)病毒病是指以圓環(huán)病毒2型（PCV-2）為主要病原、單獨(dú)、繼發(fā)或混合感染其他致病微生物的一系列疾病的總稱，是迄今為止發(fā)現(xiàn)最小的動(dòng)物病毒[4]。目前已知的PCV有2個(gè)血清型，即PCV-1和PCV-2，其中PCV-1為非致病性病毒，PCV-2為致病性病毒，它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原[3，7]。疫苗免疫可以減少該病的發(fā)生，改善生產(chǎn)性能，降低發(fā)病帶來的經(jīng)濟(jì)損失，而抗體檢測(cè)對(duì)于該病的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和免疫效果的評(píng)價(jià)具有重要作用。

目前，常用的PCV-2抗體檢測(cè)方法有間接免疫熒光（IF）、免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。IF和IPMA需要培養(yǎng)細(xì)胞接種病毒，對(duì)操作要求較高，且不適于大量樣品檢測(cè)；ELISA操作簡(jiǎn)單，特異性好，敏感性高，且能快速檢測(cè)大量的樣品，適合于大規(guī)模臨床檢測(cè)應(yīng)用[8-10]。

然而，目前市場(chǎng)上的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒只能檢測(cè)針對(duì)Cap蛋白的抗體，Cap蛋白抗體存在于疫苗免疫和野毒感染的豬體內(nèi)，這一檢測(cè)結(jié)果對(duì)于疫病診斷幫助不大。目前國內(nèi)商品化的圓環(huán)病毒疫苗均為滅活疫苗或亞單位疫苗（抗原為Cap蛋白），因此研發(fā)可用于鑒別自然感染和疫苗免疫的試劑盒是未來發(fā)展的趨勢(shì)。

REP蛋白為豬圓環(huán)病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，與圓環(huán)病毒的復(fù)制有關(guān)，只有當(dāng)圓環(huán)病毒感染豬后才能在血清中檢測(cè)到針對(duì)REP蛋白的抗體，說明REP蛋白可作為診斷圓環(huán)病毒疫苗免疫和野毒感染的診斷抗原[11]。該研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，可溶性地表達(dá)了PCV-2b的REP蛋白，并通過鎳柱親和層析對(duì)重組REP蛋白進(jìn)行了純化，純化后的重組REP蛋白Western Blot及間接ELISA鑒定結(jié)果表明該重組蛋白可以與陽性豬血清（圓環(huán)病毒抗原、抗體陰性豬PCV-2攻毒后分離血清）發(fā)生反應(yīng)，且不與疫苗免疫后陽性血清（圓環(huán)病毒抗原、抗體陰性豬疫苗免疫后分離血清）發(fā)生反應(yīng)，表明該重組REP蛋白具有較好的特異性，可用于圓環(huán)病毒感染的快速阻斷。

該研究中表達(dá)的可溶性重組REP蛋白具有較好的免疫原性，是較好的診斷抗原，這將為開發(fā)鑒別豬群是否存在圓環(huán)病毒感染的新型診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。

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