孫雁霞 時(shí)羽杰 羅倩 唐媛 田計(jì)均 鄔曉勇

摘要：為研究二元雙水相體系對(duì)歐李種仁清蛋白和球蛋白的萃取條件，采用（乙醇+丙酮）（二者體積比為1∶2）/硫酸銨構(gòu)成的二元雙水相體系，對(duì)歐李種仁的清蛋白和球蛋白分別進(jìn)行萃取，通過比較2種蛋白在此二元雙水相體系中的分配系數(shù)、回收率等特性，最終確定歐李種仁清蛋白和球蛋白的最佳萃取條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)二元雙水相體系組成為27.5%（乙醇+丙酮）（二者體積比為1∶2）和26%硫酸銨時(shí)，清蛋白的分配系數(shù)最小，萃取率達(dá)到最大；當(dāng)二元體系組成為17.5%（乙醇+丙酮）（二者體積比為1∶2）和24%硫酸銨時(shí)，球蛋白的分配系數(shù)最小，萃取率達(dá)到最大。二元雙水相體系為分離清蛋白與球蛋白提供了新的途徑，在植物來源的清蛋白與球蛋白提取中具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：生物工程其他學(xué)科； 二元雙水相體系；萃??；球蛋白；清蛋白

中圖分類號(hào)：O652.62；Q512+.1；Q512+.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Extraction of globulin and albumin from Cerasus humilis by

binary aqueous two-phase system

SUN Yanxia1，2， SHI Yujie1，2， LUO Qian1，2， TANG Yuan1，2， TIAN Jijun1，2， WU Xiaoyong1，2

（1.College of Pharmacy and Biological Engineering， Chengdu University， Chengdu， Sichuan 610106， China；2.The Ministry of Agriculture Key Laboratory of Cereal Processing， Chengdu， Sichuan 610106， China）

Abstract：In order to optimize the extraction conditions， an binary aqueous two-phase system （BATPS） composed of ethanol and acetone（volume ratio is 1∶2） and ammonium sulphate is selected to extract globulin and albumin from Cerasus humilis seeds. The distribution characteristic of the globulin and albumin in this aqueous two-phase system is reflected by comparing critical data such as partition coefficient and recovery rate. The experiment shows that the optimum conditions of albumin is composed of 27.5% ethanol and acetone （volume ratio is 1∶2）， and 26% ammonium sulphate， the optimum conditions of globulin is composed of 17.5% ethanol and acetone（volume ratio is 1∶2）， and 24% ammonium sulphate. These results suggest that the BATPS is efficient in extracting albumin and globulin with bright application prospect， and has great potential to be used in natural protein extraction.

Keywords：other disciplines of bioengineering； binary aqueous two-phase system （BATPS）； extraction； globulin； albumin

清蛋白（又稱為白蛋白）與球蛋白是自然界中分布非常廣泛的蛋白，幾乎存在于所有動(dòng)植物的體內(nèi)[1-3]。球蛋白因具有免疫作用，所以也將之稱為免疫球蛋白。清蛋白能溶于水、稀的酸溶液與堿溶液，同時(shí)可以沉淀于飽和硫酸銨溶液中；而球蛋白不溶于水，可溶于稀的鹽溶液，能夠被半飽和硫酸銨溶液沉淀[4-5]。由于清蛋白與球蛋白的功能存在差異，因此在實(shí)際生產(chǎn)中需要利用二者理化性質(zhì)的不同將它們進(jìn)行分離。球蛋白與清蛋白理化性質(zhì)的不同導(dǎo)致在雙水相體系中分配特性的不同，由此便可以改變二元雙水相體系上下相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對(duì)球蛋白和清蛋白進(jìn)行分離，并且利于放大進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

近年來，在傳統(tǒng)萃取技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的高分子聚合物雙水相萃取體系、表面活性劑雙水相體系、小分子有機(jī)溶劑雙水相萃取體系在分離/富集生物活性物質(zhì)方面得到了廣泛應(yīng)用[6-9]。現(xiàn)有的雙水相體系萃取技術(shù)大多采用的是一元雙水相體系，中國(guó)對(duì)于二元雙水相體系用于蛋白質(zhì)的研究還比較少[10-11]。筆者在一元雙水相體系的基礎(chǔ)上，利用有機(jī)溶劑相似相溶的原理，根據(jù)不同種類有機(jī)物的特性和優(yōu)點(diǎn)選取了乙醇和丙酮混合液作為新型二元雙水相體系的有機(jī)相，構(gòu)成新型體系對(duì)球蛋白和清蛋白進(jìn)行萃取[12-14]。在（乙醇+丙酮） 體系中，通過加入硫酸銨形成二元雙水相體系，考察了影響雙水相形成的因素，重點(diǎn)考察了二元體系的組成對(duì)歐李種仁球蛋白和清蛋白分配行為的影響，為二元雙水相體系萃取蛋白提供一定的理論基礎(chǔ)。

1主要材料

成熟歐李種仁經(jīng)初步分離得到的清蛋白和球蛋白粗制品。

牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)、無水乙醇、丙酮、硫酸銨等，以上試劑均為分析純。

紫外分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司提供；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司提供。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1歐李種仁球蛋白與清蛋白的制備

選取飽滿均勻的成熟歐李種子，按照文獻(xiàn)＼[15＼]的方法，采用堿提酸沉的方法獲得總蛋白，之后經(jīng)過系列操作分別得到歐李種仁的球蛋白和清蛋白粗制品，冷凍干燥后備用。將所得含清蛋白的上清液A與含球蛋白的上清液B冷藏備用。

2.2雙水相萃取方法[16-19]

取5支刻度管編號(hào)。稱取一定量乙醇和丙酮的混合液（二者體積比為1∶2）、硫酸銨固體、蛋白稀釋液、蒸餾水于刻度管中，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解。然后在每支刻度管內(nèi)加入相應(yīng)的蛋白稀釋液，使雙水相體系總質(zhì)量為10.00 g，充分振蕩后，靜置10 min。兩相分離，蛋白質(zhì)富集于雙水相系統(tǒng)的下相中，測(cè)定相比R（見式（1））和蛋白質(zhì)的含量，并計(jì)算分配系數(shù)K（見式（2））及上下相的蛋白回收率Yt和Yb（見式（3）和式（4））。

式中：Yt和Yb分別代表上相和下相的蛋白回收率。

2.3球蛋白與清蛋白二元雙水相體系的確定[12，18]

確定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)，改變有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別計(jì)算出有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同的各個(gè)體系的分配系數(shù)，選取分配系數(shù)最小的體系中的有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最優(yōu)體系的有機(jī)相。

選取分配系數(shù)最小的體系中的有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)且固定，改變硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別計(jì)算出硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同的各個(gè)體系的分配系數(shù)，選取分配系數(shù)最小的體系中的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最優(yōu)體系的鹽相，由此可確定以上相應(yīng)的有機(jī)相及硫酸銨即為萃取蛋白的最優(yōu)體系。

3結(jié)果與分析

3.1（乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)歐李種仁球蛋白萃取的影響

在（乙醇+丙酮）/硫酸銨二元雙水相體系中，固定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.0%，17.5%，20.0%，22.5%和25.0%的有機(jī)相及相應(yīng)質(zhì)量的蒸餾水組成二元雙水相體系，使其為體系A(chǔ)。后于每支刻度管中加入1 mL球蛋白稀釋液，充分振蕩后靜置10 min。待充分萃取后，分別讀出上下相體積，且通過紫外分光光度計(jì)在595 nm處測(cè)得上下相溶液的吸光度值，如表1所示。

通過表1中溶液上下相的體積和吸光度計(jì)算出歐李種仁球蛋白在二元雙水相體系1中的相比、分配系數(shù)和回收率，如表2所示。

對(duì)于實(shí)驗(yàn)所采用的二元雙水相體系來說，希望蛋白質(zhì)盡可能地分配在下相的硫酸銨溶液中，有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)歐李種仁球蛋白分配系數(shù)和回收率的影響趨勢(shì)如圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)有機(jī)相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%時(shí)，分配系數(shù)達(dá)到最小，且下相回收率達(dá)到最大。由此可確定萃取球蛋白的最佳體系中有機(jī)相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%。

3.2硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)歐李種仁球蛋白萃取的影響

在（乙醇+丙酮）/硫酸銨二元雙水相體系中，固定有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，22%，24%，26%和28%的硫酸銨及相應(yīng)質(zhì)量的蒸餾水組成二元雙水相體系，使其為體系B。然后于每支刻度管中加入1 mL球蛋白稀釋液，充分振蕩后靜置10 min。待充分萃取后，分別讀出上下相體積，且通過紫外分光光度計(jì)在595 nm處測(cè)得上下相溶液的吸光度值，如表3所示（當(dāng)有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，加入球蛋白稀釋液前雙水相體系分層，加入蛋白后體系不再分層）。

通過表3中溶液上下相的體積和吸光度，計(jì)算出歐李種仁球蛋白在二元雙水相體系B中的相比、分配系數(shù)和回收率，如表4所示。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)球蛋白萃取的分配系數(shù)和回收率的影響趨勢(shì)如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%時(shí)，分配系數(shù)達(dá)到最低且下相回收率達(dá)到最高。由此可確定該二元雙水相體系萃取球蛋白最佳體系的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%。

綜上所述，當(dāng)雙水相中有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%時(shí)，此體系為萃取歐李種仁球蛋白的最佳二元雙水相體系。

3.3（乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)歐李種仁清蛋白萃取的影響

在（乙醇+丙酮）/硫酸銨二元雙水相體系中，固定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0%，22.5%，25.0%，27.5%和30.0%的有機(jī)相及相應(yīng)質(zhì)量的蒸餾水組成二元雙水相體系，使其為體系C。然后于每支刻度管中加入1 mL清蛋白稀釋液，充分振蕩后靜置10 min。待充分萃取后，分別讀出上下相體積，且通過紫外分光光度計(jì)在595 nm處測(cè)得上下相溶液的吸光度值，如表5所示。

通過表5中溶液上下相的體積和吸光度計(jì)算出歐李種仁清蛋白在二元雙水相體系C中的相比、分配系數(shù)和回收率，如表6所示。有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)清蛋白萃取的分配系數(shù)及下相回收率的影響趨勢(shì)如圖3所示。

由圖3可知，當(dāng)有機(jī)相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.5%時(shí)，分配系數(shù)最小，且下相的回收率達(dá)到最高，所以萃取清蛋白最佳體系的有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.5%。

3.4硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)歐李種仁清蛋白萃取的影響

在（乙醇+丙酮）/硫酸銨二元雙水相體系中，固定有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.5%，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，22%，24%，26%和28%的硫酸銨及相應(yīng)質(zhì)量的蒸餾水組成二元雙水相體系，使其為體系D。然后于每支刻度管中加入1 mL清蛋白稀釋液，充分振蕩后靜置10 min。待充分萃取后，分別讀出上下相體積，且通過紫外分光光度計(jì)在595 nm處測(cè)得上下相溶液的吸光度值，如表7所示。

通過表7中溶液上下相的體積和吸光度計(jì)算出歐李種仁清蛋白在二元雙水相體系D中的相比、分配系數(shù)和回收率，如表8所示。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)清蛋白萃取的分配系數(shù)和下相回收率的影響趨勢(shì)如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%時(shí)，分配系數(shù)最小，且下相的回收率達(dá)到最高，所以萃取清蛋白最佳體系的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%。

綜上所述，當(dāng)雙水相中有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.5%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%時(shí)，此體系即為萃取歐李種仁清蛋白的最佳二元雙水相體系。

4結(jié)語

不同蛋白在相同溶劑中的溶解度會(huì)有所不同，這是由于理化性質(zhì)不同造成的[20]。清蛋白與球蛋白的理化性質(zhì)存在較大差異，清蛋白能溶于水，可以沉淀于飽和硫酸銨溶液中。球蛋白的親水性不如清蛋白，不溶或微溶于水，能溶于稀鹽溶液，在半飽和硫酸銨溶液中能夠被沉淀，根據(jù)理化性質(zhì)的不同就能對(duì)這2種蛋白進(jìn)行分離。無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度有所不同[21]，因此相同蛋白質(zhì)在二元雙水相不同體系中的分配系數(shù)會(huì)有不同，固定其中一相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，改變另一相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，選擇分配系數(shù)最小的相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為萃取蛋白質(zhì)的最優(yōu)體系。

本實(shí)驗(yàn)采用二元雙水相體系（乙醇+丙酮）（二者體積比為1∶2）/硫酸銨對(duì)歐李種仁的球蛋白和清蛋白進(jìn)行萃取，確定了萃取球蛋白的最佳條件：有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%。萃取清蛋白的最佳條件：有機(jī)相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.5%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%。

本研究利用二元雙水相系統(tǒng)對(duì)歐李種仁的清蛋白和球蛋白進(jìn)行了萃取探索，初步獲得了2種蛋白最優(yōu)的萃取條件，為活性蛋白的分離純化開辟了一條新的途徑。本次實(shí)驗(yàn)并未對(duì)蛋白在此二元雙水相系統(tǒng)中的分配行為進(jìn)行深入探討，今后應(yīng)從萃取動(dòng)力學(xué)方面入手進(jìn)行深入研究，以期獲得利用二元雙水相萃取蛋白更多的數(shù)據(jù)，為活性蛋白的分離純化提供重要的理論依據(jù)。

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