不同強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練對心肌凋亡途徑微小RNA及其靶蛋白的影響*

趙永才，付近梅，高炳宏△

（1.上海體育學(xué)院，上海200438；2.江西省體育科學(xué)研究所，南昌330006）

凋亡是細(xì)胞發(fā)生的一種程序性死亡，由基因控制的細(xì)胞主動性死亡過程。凋亡在生長發(fā)育、預(yù)防有絲分裂組織癌變等生理過程中起積極作用，但過高水平凋亡卻與心肌組織功能紊亂、心血管疾病發(fā)病密切相關(guān)。心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，其凋亡的發(fā)生對心肌生理機(jī)能影響較大，雖然心肌細(xì)胞也存在微弱增殖能力，但效率過低，不足以彌補(bǔ)一些病理應(yīng)激所引發(fā)的細(xì)胞流失［1］。因此尋求干預(yù)手段來減少、延緩心肌細(xì)胞凋亡成為研究熱點。

線粒體調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡信號，各類應(yīng)激可引發(fā)線粒體膜電位發(fā)生變化，改變線粒體膜Bcl-2的表達(dá)和定位，影響細(xì)胞色素 c釋放和 caspase蛋白激活［2］；外源性凋亡途徑中，Programmed cell death 4（PDCD4）分子在促凋亡發(fā)生中起關(guān)鍵作用。微小RNA（microRNAs，miRs）在心肌細(xì)胞內(nèi)、外源凋亡途徑中發(fā)揮作用，miR-1在心肌中特異性高表達(dá)，直接以Bcl-2 mRNA為靶目標(biāo)，抑制其蛋白表達(dá)，一定程度發(fā)揮促凋亡的作用［3］。而 miR-21以 PDCD4 mRNA為靶目標(biāo)，抑制其蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用［4］。研究認(rèn)為適當(dāng)運(yùn)動能夠降低人群心血管應(yīng)激所引發(fā)的死亡率［5］。動物研究也表明運(yùn)動可減少高血壓心肌細(xì)胞內(nèi)外源凋亡信號強(qiáng)度［6］。運(yùn)動訓(xùn)練干預(yù)心肌凋亡的過程中，相關(guān)miRs以及下游靶蛋白有何變化，目前報道較少。本文考察游泳訓(xùn)練對心肌miR-1、miR-21以及 Bcl-2、PDCD4、Bax蛋白的影響，討論運(yùn)動干預(yù)心肌凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

21只雄性 2月齡 C57BL／6小鼠，平均體重為（17±1.8）g，分籠飼養(yǎng)。普通動物飼料自由取食、飲水。采用人工照明模擬晝夜節(jié)律，隨機(jī)分3組（n＝7）：安靜組（sedentary group，SE）、訓(xùn)練組 1（exercise training group 1，ET1），訓(xùn)練組 2（exercise training group 2，ET2）。

1.2 游泳運(yùn)動安排及取材

小鼠先進(jìn)行1周適應(yīng)性游泳。實驗正式開始，SE組不做運(yùn)動干預(yù)；ET1組進(jìn)行8周游泳運(yùn)動訓(xùn)練，每周前5 d運(yùn)動，每天1次，第1周30 min／count，以后每周每次再增加10 min，最后兩周訓(xùn)練時間維持在90 min；ET2組前5周運(yùn)動方案與ET1相同，后3周每天訓(xùn)練2次（早、晚各1次），每次訓(xùn)練時間和ET1相同。訓(xùn)練結(jié)束后，取小鼠心肌組織，一部分用于制作TUNEL檢測切片，另一部分-80℃冷凍備用。

1.3 TUNEL凋亡檢測方法

使用 TUNEL檢測試劑盒（Promega公司）進(jìn)行TUNEL凋亡檢測：使用二甲苯2次脫蠟，梯度濃度酒精脫水，多聚甲醛固定；20μg／ml蛋白酶 k室溫孵育，多聚甲醛固定；Equilibration Buffer室溫平衡10 min，rTdT反應(yīng)液 37℃孵育 60 min；3%H2O2室溫封閉 10 min，加 Streptavidin HRP（1∶500 PBS稀釋）；顯色后封片。隨機(jī)視野下計數(shù)總細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，獲取凋亡指數(shù)。

1.4 miRs檢測

1.4.1 引物設(shè)計及miRs逆轉(zhuǎn)錄 Invitrogen公司提供RNA提取試劑盒，嚴(yán)格操作抽提總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，符合實驗要求，然后采用miRs-Stem-Loop反轉(zhuǎn)錄引物合成 cDNA。Primer 5.0引物軟件設(shè)計所需引物，依據(jù)檢測目標(biāo)（miR-1、miR-21和U6內(nèi)參）的序列設(shè)計擴(kuò)增引物（表1）。

1.4.2 RT-PCR反應(yīng) 擴(kuò)增反應(yīng)包括如下各類試劑：提取的 cDNA 1μl，miRs上游引物 0.5μl，通用型miRs下游引物 0.5μl，Power SYBR Green PCR Master Mix 10μl（SYBR Green、DNA聚合酶、dNTP、Buffer），無核酸酶水8μl。完成共計40個反應(yīng)循環(huán)，擴(kuò)增溫度如下：95℃變性 10 min；95℃15 s；60℃1 min。應(yīng)用ABI 7900 PCR儀，指標(biāo)有：熔解曲線、CT值及△CT值。miRs相對含量用 2-ΔΔCT公式計算。

Tab.1Primers of miR-1 and miR-21

1.5 Western blot檢測蛋白的表達(dá)

利用Western blot技術(shù)檢測目的蛋白相對表達(dá)量，先提取總蛋白，蛋白上樣后電泳，使用PVDF膜將蛋白轉(zhuǎn)印，4℃孵育過夜，Bcl-2、Bax和PDCD4一抗（Santa Cruz提供）稀釋濃度均為 1∶1 000，GAPDH抗體稀釋濃度為1∶10 000。凝膠成像系統(tǒng)獲得目的蛋白灰度。經(jīng)過數(shù)值轉(zhuǎn)化，SE組均值為1，對比觀察其它組表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計分析

使用 PASW Statistics 18.0統(tǒng)計軟件，One-way ANOVA統(tǒng)計方法分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動訓(xùn)練對心肌凋亡的影響

相比 SE組凋亡指數(shù)（2.26±0.55）%，ET1組凋亡指數(shù) （2.41±0.56）%無顯著變化，ET2組凋亡指數(shù)（1.45±0.39）%顯著性下降（P＜0.01）；ET2組凋亡指數(shù)也顯著低于 ET1組（P＜0.01）。

2.2 運(yùn)動訓(xùn)練后心肌miR-1、miR-21表達(dá)結(jié)果

相比SE組、ET1組miR-1的下降趨勢不明顯，但 ET2組miR-1降低幅度達(dá)29%（P＜0.01）；ET1組miR-21表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢，ET2組miR-21表達(dá)升高幅度大，具有顯著性差異（P＜0.05，表 2）。

2.3 運(yùn)動訓(xùn)練后心肌Bcl-2、PDCD4和Bax蛋白表達(dá)的變化

MiRs可抑制靶蛋白表達(dá)，通過免疫印跡法分別測定miR-1、miR-21的靶蛋白 Bcl-2和 PDCD4，另外Bax蛋白在線粒體途徑凋亡信號中起促凋亡作用，一并檢測。運(yùn)動訓(xùn)練促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，ET1組和ET2組表達(dá)均顯著性高于SE組，提高幅度分別達(dá)86%和98%（P＜0.01）；PDCD4蛋白表達(dá)未呈現(xiàn)顯著性變化，相比SE組，ET1組和ET2組表達(dá)僅有降低趨勢，無統(tǒng)計意義；Bax蛋白變化與Bcl-2相反，相比SE組，ET1組和ET2組表達(dá)均顯著性降低，降幅分別達(dá)38%和 60% （P＜0.01，圖1）。

Tab.2 Expressions of myocardial miR-1 and miR-21 after training（±s，n＝7）

Tab.2 Expressions of myocardial miR-1 and miR-21 after training（±s，n＝7）

SE：Sedentary group；ET1：Exercise group 1；ET2：Exercise group 2*P＜0.05，**P＜0.01 vs SE group

Group miR-1 miR-21 SE 1.47±0.22 1.22±0.10 ET1 1.38±0.15 1.27±0.24 ET2 1.05±0.19** 1.43±0.23*

Fig.1 Effects of exercise training on Bcl-2、PDCD4 and Bax levels

2.4 miRs和靶蛋白相關(guān)性及訓(xùn)練后Bcl-2／Bax的變化

對本次研究篩選的miRs和靶蛋白表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。在不同負(fù)荷狀態(tài)下，miR-1和Bcl-2呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；而本次研究miR-21和 PDCD4并沒有呈現(xiàn)顯著性負(fù)相關(guān)。另外對Bcl-2和Bax相對表達(dá)比值進(jìn)行計算，Bcl-2和Bax分別代表內(nèi)源性凋亡途徑抗凋亡和促凋亡的信號蛋白，研究發(fā)現(xiàn) ET1組 Bcl-2／Bax比值增加 2倍，ET2組增加接近4倍，都具有顯著性差異（P＜0.01，圖2）。

3 討論

Fig.2 Correlation between miRs and miR-targeted protein and the Bcl-2／Bax ratio

心臟在經(jīng)歷各類不良應(yīng)激時凋亡水平會增加，例如缺血／再灌注、心衰以及衰老，另一方面，各種原因引發(fā)的過高水平心肌凋亡又加劇心臟機(jī)能的衰退，是各類心臟病發(fā)病的病理基礎(chǔ)［7］。因此尋求各類干預(yù)心肌凋亡的手段，提高心肌的抗凋亡能力、減少心肌細(xì)胞凋亡流失是目前應(yīng)用基礎(chǔ)研究的熱點。目前認(rèn)為運(yùn)動具有心肌保護(hù)效應(yīng)，尤其降低病理狀態(tài)下凋亡效應(yīng)更佳。例如高血壓大鼠心肌凋亡水平相對較高，而運(yùn)動訓(xùn)練能夠降低高血壓大鼠心肌凋亡指數(shù)，減少內(nèi)外源途徑促凋亡蛋白的表達(dá)［6］。高脂飲食可建立大鼠肥胖模型，肥胖大鼠血脂紊亂，心肌細(xì)胞凋亡水平升高，6周游泳訓(xùn)練能夠降低肥胖大鼠心肌凋亡水平，認(rèn)為與心肌抗氧化酶增加、一氧化氮合酶減少有關(guān)［8］。生理狀態(tài)下運(yùn)動訓(xùn)練是否能干預(yù)心肌凋亡，也有研究進(jìn)行考察，但結(jié)論有異同。Siu等人［9］早期對成年健康大鼠進(jìn)行8周跑臺耐力訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練組大鼠心肌Bcl-2、HSP70和Mn-SOD顯著提高，認(rèn)為跑臺訓(xùn)練可提高生理水平心肌細(xì)胞抗凋亡基因表達(dá)，減少心肌凋亡流失。而來自Kwak等人［10］的研究認(rèn)為游泳訓(xùn)練可明顯降低衰老大鼠心肌凋亡水平，但對成年大鼠心肌凋亡影響不明顯。目前認(rèn)為運(yùn)動保護(hù)心肌效應(yīng)主要與心肌線粒體適應(yīng)有關(guān)，運(yùn)動可增加線粒體抗氧化物質(zhì)儲備，在氧化應(yīng)激下可減少線粒體細(xì)胞色素C釋放，減少心肌凋亡水平［5］。本實驗表明生理狀態(tài)下，本次ET2組中等強(qiáng)度負(fù)荷訓(xùn)練有效延緩小鼠心肌凋亡，對心肌具有一定保護(hù)效應(yīng)。

miRs屬于約22nt長非編碼RNA，可與靶蛋白mRNA結(jié)合，抑制蛋白翻譯表達(dá)或者降解 mRNA，miRs參與到心臟功能的調(diào)節(jié)，包括心肌生長、電傳導(dǎo)、心肌收縮和凋亡等過程［11］，其中 miR-1和 miR-21明顯調(diào)節(jié)心肌凋亡。研究［3］認(rèn)為miR-1特異性在心肌中高表達(dá)，可以通過抑制下游靶蛋白調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡，miR-1直接以Bcl-2為靶目標(biāo)，抑制Bcl-2 mRNA翻譯表達(dá)控制心肌凋亡水平。本次研究發(fā)現(xiàn)ET2組運(yùn)動訓(xùn)練顯著降低心肌miR-1表達(dá)，但ET1組miR-1表達(dá)降低無統(tǒng)計意義。與miR-1變化相反，兩個訓(xùn)練組Bcl-2表達(dá)均顯著性提高，表明miR-1下降可能有利于Bcl-2生成表達(dá)，這種效應(yīng)在ET2組體現(xiàn)更明顯。對miR-1和Bcl-2進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著性負(fù)相關(guān)。以上表明miR-1和Bcl-2變化對運(yùn)動訓(xùn)練的適應(yīng)性變化可能是運(yùn)動訓(xùn)練減緩心肌凋亡的機(jī)制之一，尤其ET2組中等負(fù)荷強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練可能通過miR-1和Bcl-2的變化延緩心肌凋亡。相對而言，ET1組小強(qiáng)度耐力訓(xùn)練對miR-1和Bcl-2影響相對較小。

MiR-21在心肌中表達(dá)比較豐富，目前發(fā)現(xiàn)其在凋亡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，心梗模型過表達(dá)miR-21能夠明顯降低細(xì)胞凋亡水平，并減少心梗區(qū)域面積并改善左心室重塑水平［12］。另一項研究［4］證實 miR-21能夠直接結(jié)合PDCD4 mRNA，靶向抑制其表達(dá)，對抗凋亡。本次研究發(fā)現(xiàn)ET1組miR-21無明顯變化，ET2組miR-21表達(dá)顯著提高，而ET1、ET2組PDCD4蛋白表達(dá)均無顯著性變化，僅有下降趨勢，表明PDCD4蛋白對本次研究兩種運(yùn)動負(fù)荷不敏感。另外也并未發(fā)現(xiàn)miR-21和PDCD4有顯著負(fù)相關(guān)。有其它研究［13］發(fā)現(xiàn)miR-21和PDCD4在不同心肌缺血預(yù)適應(yīng)模型中變化缺乏規(guī)律，無相關(guān)性，說明miR-21和PDCD4調(diào)節(jié)比較復(fù)雜，體內(nèi)實驗中PDCD4可能受更多其它因素調(diào)節(jié)，訓(xùn)練對其干預(yù)不明顯?？傮w上盡管ET2組訓(xùn)練負(fù)荷提高miR-21表達(dá)，但PDCD4對訓(xùn)練不敏感，miR-21和PDCD4變化特點與ET2組凋亡指數(shù)下降不吻合，可能不參與運(yùn)動干預(yù)心肌凋亡的分子調(diào)節(jié)中。本研究認(rèn)為miR-1及靶蛋白Bcl-2對訓(xùn)練的適應(yīng)變化可能參與到運(yùn)動保護(hù)心肌效應(yīng)的分子調(diào)節(jié)通路，但miR-21和靶蛋白PDCD4變化并不參與此調(diào)節(jié)通路。值得關(guān)注的是基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)miR-21具有心肌保護(hù)效應(yīng)，而且其靶蛋白眾多，還包括FasL、PTEN等［14］，miR-21是否通過抑制其它靶蛋白參與運(yùn)動保護(hù)心肌效應(yīng)還有待考察。

本次研究對Bax也進(jìn)行測定，對比Bcl-2／Bax比值對運(yùn)動訓(xùn)練的適應(yīng)情況，在內(nèi)源性凋亡途徑中，Bcl-2起抗凋亡的作用，而Bax代表促凋亡的因子，兩者比值變化一定程度上反映凋亡信號的轉(zhuǎn)變。本次研究發(fā)現(xiàn)兩種訓(xùn)練負(fù)荷均顯著提升Bcl-2／Bax比值，表明兩種訓(xùn)練負(fù)荷均能提高抗凋亡的信號強(qiáng)度，結(jié)合兩個訓(xùn)練組凋亡指數(shù)，相對而言，只有ET2組中等負(fù)荷強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練能夠顯著降低心肌凋亡水平。

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