龔麗景，付鵬宇，朱鑫，汪 蕾，胡 揚△

（1.北京體育大學中國運動與健康研究院，2.運動人體科學學院，北京100084）

自從利用氟脫氧葡萄糖-正電子發(fā)射體層攝影（fluorodeoxyglucose-position emission tomography，F(xiàn)DGPET）技術(shù)探查到成人體內(nèi)也存在活性棕色脂肪（brown adipose tissue，BAT）［1］后，學者試圖尋找活化BAT的方法，發(fā)揮其產(chǎn)熱、促進能量代謝和消耗脂肪的作用，以達到減脂控重的目的。目前認為BAT有兩種來源：一是與白色脂肪（white adipose tissue，WAT）細胞同源，二是和肌肉細胞同源［2］。而低氧暴露作為影響肌肉功能的敏感因素和調(diào)控能量代謝的有效手段［3］，其對BAT的影響還鮮有研究，而mRNA表達譜芯片作為一種快速、高敏、高效的生物信息學手段，可將不同生理病理狀態(tài)（正常與肥胖）下或?qū)φ蘸吞幚恚ǖ脱鹾统Ｑ酰┑募毎蚪M織的mRNA進行定性和定量比較，從而為基因?qū)用嫒嫜芯康脱鯇Ψ逝謾C體BAT的影響提供思路。因此，本實驗擬利用mRNA表達譜芯片分析4周的低氧暴露對肥胖小鼠BAT的差異表達基因和通路，以探討低氧如何通過棕色脂肪組織產(chǎn)熱過程達到減肥的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

離乳雄性C57BL／6J小鼠30只（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK-（京）2015-0004），初始體重為（8.2±0.1）g，隨機分為普通對照組（N，n＝8），喂以普通維持飼料；高脂組（HD，n＝22）喂以高脂飼料（D12109C：Rodent Diet with 40 kcal%Fat，Research Diet公司）。飼喂8周建立肥胖模型后（以HD組大于N組平均體重的20%作為肥胖模型建立成功判斷標準），隨機分為：肥胖對照組（OB，n＝8）和肥胖低氧組（H，n＝8），H組的低氧方案為 8 h／d、6天／周，氧濃度為 11.2%（相對于海拔4 500 m），共4周的低氧暴露［通過制氮機（北京創(chuàng)文氣體有限公司）、凍干機（杭州超濾）和空氣壓縮機（美國英格索蘭）共同作用將空氣中的氮氣通入動物飼養(yǎng)室內(nèi)達到氧濃度］。每周記錄各組小鼠體重和攝食量。飼養(yǎng)與低氧暴露均在北京體育大學動物實驗室［許可證號：SYXK（京）2011-0034］內(nèi)進行。本實驗經(jīng)過北京體育大學運動科學倫理審查委員會的批準（批準號：2015040）。

1.2 取材

4周低氧暴露結(jié)束，禁食12 h，小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液，心臟取血后收集血清，肩胛處取BAT置于RNA store樣本保存液（DP408-02，北京天根生化科技有限公司）中，均-20℃保存。

1.3 血液生化指標檢測

日立7020全自動生化分析儀測試血液中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（cholesterol，CHO）和血糖（glucose，GLU）水平。

1.4 總RNA的提取和熒光標記

采用 mirVana miRNA Isolation Kit試劑盒提取BAT中的總RNA，并用NucleoSpin?RNA clean-up試劑盒（MACHEREY-NAGEL，Germany）純化，分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。RNA的純度（A260／280≥1.90），總量（≥10μg）和完整性均達要求后進行后續(xù)實驗。RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 Random Primer為引物進行KLENOW酶標記，標記產(chǎn)物用PCR NucleoSpinExtract II Kit（MN）純化并抽干。DNA標記后溶于雜交液中（2×GExHyb Buffer（HI-RPM），25%甲酰胺）45℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42℃左右含0.2%SDS，2×SSC的液體中洗 5 min，而后在0.2×SSC中室溫洗5 min。玻片甩干后即可用于掃描。

1.5 基因芯片的掃描和數(shù)據(jù)分析

使用Agilent G2565CA Microarray Scanner進行掃描芯片（Mouse（V2）Gene Expression Microarray，8 x 60 K，Agilent），得到雜交圖片。Feature Extraction軟件分析芯片圖像并將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。所得數(shù)據(jù)輸入GeneSpring GX軟件中，percentile shift方法對信號值進行歸一化處理。以 Absolute Fold change［FC（abs）］≥1.5，同時Flag標記為Detected的標準進行差異基因篩選。Cluster3.0軟件進行聚類分析。對所篩選的差異基因用 KOBAS2.0（KEGG Orthology Based Annotation System）軟件進行基因功能注釋（Gene Ontology，GO）和信號通路富集度統(tǒng)計分析。每組隨機取3個BAT樣本用于芯片測試；1.4和1.5過程中的操作均完成于北京博奧晶典生物有限公司。

1.6 實時熒光 qPCR（Real time-qPCR，RT-qPCR）驗證芯片準確性

按MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒（TaKaRa公司）要求提取所有樣品總 RNA，Prime-ScriptTMRT Master Mix試劑盒（TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。使用Primer5軟件設(shè)計擴增待驗證基因引物，并在上海生工生物工程股份有限公司合成引物，序列如下：Mstn：5’-CCTGGGAAGGTTACAGCAAG-3’和 5’-GGCACTGGTATTTGGCAGAG-3’；Fbp1：5’-ACATCGTTCCCACCGAGAT-3’和 5’-CACTTGGCTTTGTGCTTCCT-3’；Mttp：5’-CGGACCAGATGAAGAAGCAT-3’和 5’-CAGAGAGGCGAGAAGAGCAT-3’；Ptgis：5’-GCCTTCTCCTCTTTCCCTTC-3’和 5’-GCCGTTTCCCATCTTTGTAA-3’； Nrg2： 5’-CATCCTCCACCCTCACTTTG-3’和 5’-CCTCCTATCGCTGGTTCAAG-3’；UCP1：5’-TGGCGTGGCGGTATTCA-3’和 5’-TGGCTTTGTGCTGTGTGA-3’。以 18S（德 國 QIAGEN QT01036875）作為內(nèi)部參照基因。用SYBR Premix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行RT-qPCR反應(yīng)操作。反應(yīng)體系為：10μl SYBR Premix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）（2×），0.4μl ROX Reference Dye II，0.8 μl PCR Forward Primer（10μmol／L），0.8μl PCR Reverse Primer（10μmol／L），2μl cDNA模板，6μl RNasefree dH2O；采用兩步法PCR擴增標準程序：95℃預(yù)變性30 s，循環(huán)擴增 95℃ 5 s→60℃ 34 s（循環(huán) 40次），添加熔解曲線。采用△△Ct法（比較閾值法）表示目的基因的相對表達［4］。

1.7 統(tǒng)計學分析

所得實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 體重和攝食量

肥胖模型建立前各組小鼠體重無顯著性差異；8周構(gòu)建肥胖模型成功后，進行4周低氧暴露后，H組體重顯著低于OB組（P＜0.05）；低氧暴露前后H組與OB組相比的日平均攝食量無顯著性差異（表1）。

Tab.1 Body weight and food intake before and after hypoxia exposure（±s，n＝8）

Tab.1 Body weight and food intake before and after hypoxia exposure（±s，n＝8）

N：Normal diet control group；OB：High-fat diet control group；H：High-fat diet hypoxia group*P＜0.05 vs OB after hypoxia exposure group

Group Body weight（g） Food intake（g／d ）N 1.87±0.08 Before 20.27±0.14 1.90±0.13 After 26.21±0.75 1.85±0.21 OB Before 24.79±0.24 1.72±0.20 After 27.53±0.61 1.79±0.12 H Before 24.79±0.24 1.72±0.20 After 26.65±1.24*

2.2 各組血液生化指標的改變

與N組相比，OB組血液各項指標均出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05）。H組較OB組血清TG水平無顯著性差異，但血糖和CHO水平出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05，表 2）。

Tab.2 Results of TG、CHO and GLU in blood（mmol／L，±s，n＝8）

Tab.2 Results of TG、CHO and GLU in blood（mmol／L，±s，n＝8）

N：Normal diet control group；OB：High-fat diet control group；H：High-fat diet hypoxia group；TG：Triglyceride；CHO：Cholesterol；GLU：Glucose*P＜0.05 vs N group；#P＜0.05 vs OB group

Group TG CHO GLU N 0.29±0.02 2.03±0.09 8.5±0.78 OB 0.34±0.03* 4.54±0.30* 10.22±1.77*H 0.35±0.16 3.98±0.30# 8.06±1.29#

2.3 各組芯片掃描分析結(jié)果

2.3.1 聚類分析圖 運用Gene Spring GX軟件篩選OB組與N組及H組與OB組的表達差異基因（篩選條件錯誤檢出率（false discovery rate，F(xiàn)DR）設(shè)定為5%以內(nèi)，F(xiàn)C（abs）為1.5倍。用 Cluster 3.0軟件對篩選的表達基因進行層次聚類分析（圖1，見彩圖頁Ⅳ）。a為OB vs N聚類圖，b為H vs OB聚類圖。圖中每一條線代表一個基因，紅色表示上調(diào)表達數(shù)據(jù)，綠色表示下調(diào)，黑色表示消除或缺失（n＝3）。

Fig. 1 Clusters graph of OB vs N（a）and H vs OB（b）

2.3.2 差異基因的分析 以 FC（abs）≥1.5倍，P＜0.05為標準篩選差異表達基因后，發(fā)現(xiàn)OB組與N組相比，共有1 977個差異基因，其中上調(diào)基因802個，下調(diào)1 175個，差異基因主要生物學過程（biological Process，BP）主要涉及糖脂合成代謝及免疫炎癥反應(yīng)過程；H組與OB組相比，共有525個差異基因，其中上調(diào)297個，下調(diào)228個，BP主要包括糖脂代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和脂肪細胞分化過程，肌肉組織發(fā)育過程及脈管系統(tǒng)發(fā)育過程。KOBAS2.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，低氧暴露肥胖機體BAT過程中顯著變化的通路包括：HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、ErbB信號通路等過程。這些關(guān)鍵基因所在通路具有調(diào)節(jié)和參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能。

2.3.3 關(guān)鍵差異基因的篩選 根據(jù)差異基因的差異倍數(shù)、生物功能和所在通路，篩選以下基因作為要驗證的關(guān)鍵差異基因：Mstn、Fbp1、Mttp、Ptgis、Nrg2和UCP1（表 3）。

2.4 RT-qPCR驗證芯片結(jié)果

OB組 BAT中 Fbp1、Mttp、Ptgis和 Nrg2 mRNA水平較N組顯著降低，UCP1 mRNA水平有降低的趨勢，Mstn mRNA水平顯著上升；H組的 Fbp1、Mttp、Ptgis和Nrg2 mRNA水平較N組顯著降低，UCP1 mRNA水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。其中 H組 Mttp和 Nrg2 mRNA較 OB組明顯上升，F(xiàn)bp1、Ptgis和UCP1 mRNA水平有上升的趨勢，Mstn mRNA回降（表4）。基因RT-qPCR檢測結(jié)果與芯片結(jié)果一致，證明芯片結(jié)果的準確性。

3 討論

BAT是一種通過線粒體脂質(zhì)氧化產(chǎn)熱而促進人體的能量平衡的脂肪組織。就BAT顏色、氧化代謝方式和線粒體數(shù)量而言，其與骨骼肌的相似度遠遠高于WAT，且骨骼肌內(nèi)含有少量BAT前體細胞［5］。基于BAT產(chǎn)熱耗能的作用，增加體內(nèi)BAT量和／或增強BAT活性可以有效抑制肥胖發(fā)生和發(fā)展。寒冷和運動等刺激可以活化BAT。BAT對機體的調(diào)控作用為減少機體WAT及調(diào)節(jié)糖脂代謝水平。

BAT與骨骼肌發(fā)育功能及糖脂代謝相關(guān)過程緊密聯(lián)系。肌肉生長抑制素（Mstn）在低氧抑制肌肉生長過程中發(fā)揮著重要的作用［6］，同時參與調(diào)節(jié)脂代謝和能量消耗。本研究提示低氧會下調(diào)肥胖機體BAT中Mstn水平。Mstn缺失可通過激活脂解相關(guān)酶而促進外周和線粒體中FA的氧化，誘導(dǎo)WAT棕色化以增加產(chǎn)熱［7］；同時，使用Mstn抑制劑可以調(diào)控BAT分化，促進 PRDM16和UCP1的表達，提高BAT活性［8］；果糖二磷酸酶 1（Fbp1）在糖異生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可將果糖-l，6-二磷酸轉(zhuǎn)變成果糖-6-磷酸。Fbp1在BAT和骨骼肌中活性高于WAT，在兒茶酚胺的調(diào)控下，寒冷會增加Fbp1活性。本研究中OB組Fbp1水平顯著下降，說明肥胖下調(diào)BAT的糖代謝水平；微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（Mttp）是一種重要的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，可促進TG、CHO和磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)運［9］。高脂飲食飼喂 BAT缺失鼠會出現(xiàn)Mttp水平的降低，導(dǎo)致血脂異常和高胰島素血癥［10］。

Tab.3The information of key differential genes

Tab.4 Relative mRNA expression of differentially expressed genes（n＝6）

低氧暴露可增加基礎(chǔ)代謝量，促使能量失衡，從而使體脂率和肌肉量下降［11］、棕色脂肪占總脂肪比率及PGC-1α等基因表達顯著升高［12］。本研究H組Fbp1和Mttp含量較OB組顯著上調(diào)，提示低氧可以促進肥胖機體BAT的糖脂代謝。機體細胞在氧含量不足時會首先切換至糖分解模式以產(chǎn)生能量［13］，F(xiàn)bp1是糖異生中重要的限速酶，故低氧暴露會上調(diào)Fbp1含量以產(chǎn)能；而缺氧會使心肌細胞Mttp蛋白水平顯著上調(diào)，避免TG在心肌細胞的積累［14］。同時，H組UCP1和產(chǎn)熱相關(guān)基因前列腺素I2合成酶（Ptgis）mRNA水平較OB組出現(xiàn)上調(diào)，提示低氧暴露對BAT具有活化作用，其發(fā)揮作用可能通過以下途徑：血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）是重要的促血管生成因子，參與肥胖的發(fā)生發(fā)展。大量表達于肌肉和BAT的VEGF-B是其家族成員之一，參與脂肪酸的攝取和代謝［15，16］。低氧可通過上調(diào)VEGF基因表達而使高原土著動物適應(yīng)低氧環(huán)境［17］。本研究提示低氧暴露后HIF-1通路出現(xiàn)顯著變化，且Ptgis顯著上調(diào)，說明低氧暴露可通過上調(diào) HIF-1／VEGF／環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）／前列腺素（prostaglandin，PG）信號通路而提高BAT活性。同時，COX-2下游的前列腺素I2（環(huán)前列腺素）（prostaglandin I2，PGI2）／Ptgir／PPARγ信號通路可促使間質(zhì)祖細胞向BAT細胞分化，有助于產(chǎn)熱和增加肥胖機體的能耗［18］；叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O（forkhead transcription factor O，F(xiàn)oxO）是一種重要的腫瘤抑制因子，與肥胖與2型糖尿病發(fā)病密切相關(guān)。肥胖會導(dǎo)致FoxOmRNA水平顯著升高，且與胰島素抵抗程度及血TG水平呈正相關(guān)，此過程可能通過增加肝臟葡萄糖的輸出和TG生成而實現(xiàn)［19］。菊苣酸可通過PI3K／Akt信號通路下調(diào)3T3-L1前脂肪細胞中 PGC-1α和 FoxO4蛋白表達［20］，以發(fā)揮抗肥胖作用。本研究提示低氧暴露可通過下調(diào) BAT中PI3K／Akt／FoxO通路而調(diào)控肥胖所致的糖脂代謝紊亂；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（Nrg）是表皮生長因子大家族中一類相關(guān)蛋白質(zhì)群的總稱，與代謝密切相關(guān)。如Nrg 4在BAT分化時高表達，可通過激活BAT中的ErbB信號通路，負調(diào)控脂肪的生成，改善肥胖所致的代謝紊亂［21］。而Nrg1是調(diào)節(jié)骨骼肌代謝的重要蛋白，高脂高糖轉(zhuǎn)普通飲食可使肥胖機體Nrg1／ErbB通路活性顯著上調(diào)［21］。本研究中H組Nrg2水平較OB組顯著上調(diào)，且ErbB信號通路出現(xiàn)顯著變化，提示低氧可通過調(diào)節(jié)BAT中Nrg／ErbB通路而控制肥胖的發(fā)生。

肥胖機體在血糖血脂和體重上升同時伴隨著BAT中糖脂代謝相關(guān)基因的改變，而低氧暴露可通過調(diào)節(jié)HIF-1、PI3K-Akt、FoxO和ErbB信號通路來調(diào)節(jié)BAT的糖脂代謝，肌肉和脈管系統(tǒng)發(fā)育及產(chǎn)熱功能，從而達到提高BAT活性，改善肥胖機體代謝紊亂的作用。

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