嚴嘉琦，張 云，劉方舒，蔡聽聽，童康強，朱 燦，胡露琦，呂淑敏

（1.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，浙江紹興312000；2.寧波市杭州灣醫(yī)院兒科，浙江寧波315336）

人工關(guān)節(jié)（也稱假體）翻修術(shù)回顧性研究發(fā)現(xiàn)聚乙烯（polyethylene，PE）、金屬鈦（titanium，Ti）和磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）等三類松動假體可釋放大量的磨損顆粒，這些顆?？烧T導(dǎo)假體周圍組織細胞如巨噬細胞、成纖維細胞和成骨細胞等分泌大量的炎癥因子［1］，促進假體周圍破骨細胞生成和骨溶解。因此，磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解是假體關(guān)節(jié)松動和關(guān)節(jié)置換的主要原因之一。

假體周圍除了含上述組織細胞外，還存在著豐富的骨細胞，其數(shù)量占骨組織細胞的90%～95%。骨細胞由成骨細胞分化而來，其胞體深埋于骨陷窩中，細胞間通過其豐富的偽足彼此連接形成通訊網(wǎng)絡(luò)，維持自身生理功能或合成、分泌DMP-1及SOST等分子調(diào)控骨表面的成骨細胞和破骨細胞活動而調(diào)節(jié)骨重建與骨修復(fù)［2，3］。因此，骨細胞是維持成熟骨新陳代謝的主要細胞。以往研究結(jié)果顯示PE、鈷鉻鉬合金（Co-Cr-Mo）和TCP等磨損顆粒可誘導(dǎo)骨細胞 MLO-Y4損傷［2-4］，釋放破骨細胞活化因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和 RANKL，后者促進破骨細胞分化、存活和骨溶解［1］。因此，骨細胞參與溶骨過程，可能是研究和防治假體周圍骨溶解的另一種新的靶細胞。但是，目前有關(guān)骨細胞與磨損顆粒之間的關(guān)系研究較少，而且多為體外實驗研究，不能真實地反應(yīng)體內(nèi)假體周圍的系統(tǒng)性和復(fù)雜性。

本研究擬利用前期成功構(gòu)建的磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)假體釋放的磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解和無菌性松動病理過程［5-7］，以小鼠顱骨溶解部位周圍骨細胞為研究對象，探討TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細胞損傷情況，闡明其可能作用機制，為研究和防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動提供新的靶細胞、新方法和新治療靶點。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型建立

SPF級雄性ICR小鼠購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心（SCXK（浙）2014-0001）。實驗前動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度22℃～24℃，濕度50%～70%，動物自由進食進水，自然晝夜節(jié)律光照。取36只雄性ICR小鼠隨機分為3組（n＝12）：假手術(shù)（Sham）組、模型（TCP）組和 3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）組。腹腔注射 1.5%戊巴比妥鈉（60 mg／kg）麻醉小鼠后，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長約0.8 cm，分離皮下組織，顯露出1 cm×1 cm顱骨區(qū)域，其中Sham組進行原位縫合。TCP組和3-MA組取TCP磨損顆粒30 mg置于小鼠顱骨中縫骨膜上縫合皮膚構(gòu)建小鼠顱骨溶解模型，模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)假體周圍磨損顆粒誘導(dǎo)假體骨溶解病理過程［5-7］。3-MA組小鼠于術(shù)后第2天顱頂皮下注射3-MA（1.0 mg／kg），2 d 1次，持續(xù)干預(yù)2周。假手術(shù)組小鼠顱骨頂皮下注射等量生理鹽水，注射時間與3-MA組一致。實驗結(jié)束后取血清和顱骨（以正中矢狀縫為中心的方形區(qū)域）。

1.2 藥品與試劑

TCP磨損顆粒由浙江大學(xué)化學(xué)系饋贈；鱟試劑購自上海吳昊經(jīng)貿(mào)有限公司；SOST和 DMP-1的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Annexin-V／PI凋亡檢測試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液和HE染色液購自上海碧云天生物有限公司；3-MA購自美國 Selleck公司；DMP-1、SOST、Beclin-1、LC-3和β-actin等抗體購自美國Cell Signaling公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.3 Micro-CT掃描分析假體周圍骨溶解

小鼠顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，行Micro-CT掃描（條件為電壓 59 kV、電流 167μA、深度 16 bit、曝光時間 295 ms，分辨率為9.18μm）。將所有標(biāo)本以完整骨組織為興趣區(qū)域（region of interes，ROI）進行三維重建，應(yīng)用三維重建處理軟件和ABA專用骨骼分析軟件計算顱骨骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分數(shù)（bone volume fraction，BVF）和骨吸收孔數(shù)量的變化。

1.4 ELISA法檢測血清中DMP-1和SOST水平

通過摘小鼠眼球取血，置于4℃冰箱放置30 min，經(jīng)1 500 r／m離心10 min后取上層血清。利用牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白 1（dentin matrix protein 1，DMP-1）和骨硬化蛋白（sclerostin，SOST）的ELISA試劑盒檢測小鼠血清中DMP-1和SOST水平。

1.5 HE染色觀察假體周圍骨細胞活性

顱骨經(jīng)10%甲醛固定 48 h和10%EDTA（pH 7.4）脫鈣2周后進行石蠟包埋，后經(jīng)切片機對顱骨矢狀面連續(xù)切片 （5μm），脫蠟后行HE染色。置于IX70顯微鏡觀察假體周圍骨細胞活性及死亡（即空骨陷窩）情況變化，應(yīng)用Image Pro-Plus 6.0（美國MediaCybernetics公司）軟件分析單位面積內(nèi)空骨陷窩數(shù)。

1.6 骨細胞的獲取

參照Prideaux等［8］方法分離骨細胞。顱骨去除軟組織和骨膜后，小鼠顱骨與0.2%IV型膠原酶溶液（用含 70 mmol／L NaCl，10 mmol／L NaHCO3，60 mmol／L山梨醇，30 mmol／L KCl，3 mmol／L K2HPO4，1 mmol／L CaCl2，0.1%BSA，0.5%葡萄糖 和 25 mmol／L HEPES）在 37℃培養(yǎng)箱中孵育 20 min。去除上清液，顱骨碎片在 37℃與含 5 mmol／L EDTA和0.1%BSA消化液中消化20 min，中間用移液器吹打1次。PBS沖洗后，重復(fù)以上消化步驟4次，收集最后2步消化后的上清液。經(jīng)1 500 r／min離心10 min后取下層骨細胞。

1.7 流式細胞術(shù)定量分析骨細胞凋亡［9］

骨細胞與5μl Annexin V-FITC／碘化丙啶（propidium iodide，PI），10μl輕輕混勻后，避光室溫溫育15 min。然后加入200μl PBS并混勻，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。FITC的激發(fā)波長為488 nm，檢測發(fā)射波長 575 nm（Ex：488 nm，Em：575 nm）。

1.8 Western blot法檢測假體周圍骨細胞自噬相關(guān)蛋白的表達［10］

骨細胞加入RIPA（100μl）裂解液冰上裂解30 min。經(jīng)12 000 r／min離心15 min收集上清液即為總蛋白，通過BCATM試劑盒檢測各組骨細胞總蛋白濃度。各組蛋白提取液加入上樣緩沖液后煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30μg蛋白，行12%SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔源性一抗DMP-1（1∶500）、SOST（1∶500）、Beclin-1（1∶1 000）、LC-3（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）4°C孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni矯正的 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TCP磨損顆粒對假體周圍骨溶解的影響

Micro-CT分析和三維重建結(jié)果顯示：與Sham組相比，TCP組小鼠顱骨正中矢狀縫發(fā)生明顯骨溶解（圖1），BMD、BV／TV和骨吸收孔數(shù)顯著增加（P＜0.05，表1），表明 TCP磨損顆?？烧T導(dǎo)假體周圍骨溶解，該模型可用于研究假體周圍骨細胞損傷。

2.2 TCP磨損顆粒對誘導(dǎo)假體周圍骨細胞死亡的影響

HE染色顯示：與Sham組比較，TCP組假體周圍骨細胞活性明顯降低，死亡數(shù)明顯增加，表現(xiàn)為空骨陷窩數(shù)顯著增加（41.52 count／mm2），為 Sham組（12.15 count／mm2）的 3.42倍（圖 2）。流式細胞術(shù)定量分析結(jié)果表明TCP組假體周圍骨細胞凋亡明顯增加，其凋亡率從4.56%增加為39.41%，與 Sham組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

Fig.1 Micro-computed tomography（Micro-CT）for the calvaria osteolysis in mice

Tab.1 Changes in bone parameters（±s，n＝3）

Tab.1 Changes in bone parameters（±s，n＝3）

BMD：Bone mineral density；BV／TV：Bone volume fraction；TCP：Tricadcium phosphate*P＜0.05 vs sham group

Group BMD（mg／cc） BV／TV（%）Number of porsity Sham 666.25±4.12 39.98±1.98 21.37±2.41 TCP 634.05±2.29*26.85±2.56*56.81±4.32*

Fig.2 Viability of periprosthetic osteocytes in the mouse calvaria（HE×200）

Fig.3 Flow analysis of osteocytes apoptosis in the mouse calvaria using Annexin-V／PI double labeling

2.3 TCP磨損顆粒對假體周圍骨細胞功能損傷的影響

ELISA和免疫印跡結(jié)果顯示：TCP磨損顆粒可誘導(dǎo)假體周圍骨細胞功能損傷，表現(xiàn)為TCP組小鼠血清和假體周圍骨細胞中DMP-1水平及蛋白表達均明顯減少，而SOST水平及蛋白表達均顯著增加，與Sham組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2、圖 4）。

Tab.2 Changes in serum levels of DMP-1 and SOST（ng／ml，±s，n＝4）

Tab.2 Changes in serum levels of DMP-1 and SOST（ng／ml，±s，n＝4）

DMP-1：Dentin matrix protein 1；SOST：Sclerostin*P＜0.05 vs sham group

Group DMP-1 SOST Sham 56.36±5.31 34.78±3.04 TCP 22.13±2.70* 87.65±7.16*

Fig.4 Protein expression of DMP-1 and SOST in the calvaria osteocytes

2.4 TCP磨損顆粒對假體周圍骨細胞自噬的影響

Western blot結(jié)果顯示：與Sham組比較，TCP組假體周圍骨細胞發(fā)生自噬，表現(xiàn)為TCP組小鼠假體周圍骨細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1蛋白表達顯著增加，LC-3I向 LC-3II轉(zhuǎn)換明顯增加，造成 LC-3II／LC-3I升高，Beclin-1表達和LC-3II／LC-3I比值分別增加為Sham組的2.53和1.73倍（圖 5）。

Fig.5 Protein expression of Beclin-1 and LC-3 in the calvaria osteocytes

2.5 3-MA對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細胞損傷影響的影響

與TCP組比較，3-MA組假體周圍骨細胞損傷明顯加重，表現(xiàn)為空骨陷窩數(shù)和骨細胞凋亡率顯著增加，分別增加為 TCP組的1.70倍和 1.65倍（P＜0.05，表 3）。

3 討論

本研究首先通過Micro-CT分析證實了TCP磨損顆?？烧T導(dǎo)小鼠顱骨中縫發(fā)生骨溶解，成功模擬了關(guān)節(jié)假體周圍磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解病理過程，與以往報道結(jié)果基本一致［5-7］。因此，該模型可用于研究磨損顆粒所致的假體周圍骨細胞損傷。在此基礎(chǔ)上，本研究以假體周圍含量豐富的骨細胞為研究對象，探討TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細胞損傷情況。結(jié)果顯示TCP磨損顆?？梢种萍袤w周圍骨細胞活性，誘導(dǎo)骨細胞死亡，增加空骨陷窩數(shù)量，釋放能促進破骨細胞分化、存活和骨溶解的破骨細胞活化因子 TNF-α、IL-1β、IL-18和 IL-6［2-4］，促進假體周圍骨溶解。此外，TCP磨損顆粒還能誘導(dǎo)假體周圍骨細胞功能損傷，表現(xiàn)為TCP組血清及假體周圍骨細胞中DMP-1水平及其蛋白表達明顯減少，血清SOST水平及其蛋白表達顯著增加；而DMP-1減少和（或）SOST增加均能通過骨細胞自身豐富的偽足與假體周圍成骨細胞和破骨細胞發(fā)生通訊連接，抑制成骨細胞骨礦化和骨形成、促進破骨細胞形成和骨溶解［2，3］，調(diào)控假體周圍骨重建與骨修復(fù)。因此，TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細胞DMP-1水平減少和SOST水平增加可促進假體周圍骨溶解。

Tab.3 Effect of 3-MA on osteocytes injuries in the mouse calvaria（±s，n＝4）

Tab.3 Effect of 3-MA on osteocytes injuries in the mouse calvaria（±s，n＝4）

Group Empty osteocytes lacunae（1／mm2）Apoptosis（%）Sham 12.15±1.91 4.01±1.27 TCP 41.52±7.12* 35.49±4.61*3-MA 70.43±4.78# 58.87±4.61#

大量研究表明骨細胞的數(shù)量、活性及其功能對骨量的維持和骨重建起著重要的作用［2-4，8］，而骨細胞凋亡常常伴隨著骨質(zhì)疏松癥或骨關(guān)節(jié)炎等骨吸收疾病的發(fā)生，同時會引起骨脆性增加和骨修復(fù)能力減弱［11，12］。Emerton等［11］觀察到雌激素缺乏的小鼠股骨皮質(zhì)骨吸收與骨細胞凋亡呈正相關(guān)。2016年Cabahug-Zuckerman研究小組又發(fā)現(xiàn)后肢卸載的小鼠股骨皮質(zhì)骨和骨小梁骨細胞發(fā)生凋亡及骨丟失顯著；應(yīng)用Caspase抑制劑QVD能顯著抑制上述骨細胞凋亡骨吸收［12］。本研究發(fā)現(xiàn)TCP磨損顆粒能誘導(dǎo)假體周圍骨細胞死亡及凋亡，與TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解趨勢基本一致。推測骨細胞凋亡參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍溶解。另外，有研究證實自噬調(diào)控成骨細胞和破骨細胞活動［13，14］，在骨重建和骨吸收疾病中發(fā)揮重要的作用。但是，目前關(guān)于自噬參與骨細胞調(diào)控骨重建的研究并不多。Zahm等［15］研究顯示自噬標(biāo)志蛋白LC3II在正常小鼠和人的皮質(zhì)骨骨細胞中高表達；2014年又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏骨質(zhì)疏松大鼠脛骨近端骨細胞自噬，且自噬的活化與氧化應(yīng)激程度密切相關(guān)［16］；2015年 Toscani等［17］也觀察到蛋白酶抑制劑硼替佐米能減少多發(fā)性骨髓瘤患者骨細胞自噬和凋亡，促進骨細胞存活；本研究結(jié)果也顯示TCP磨損顆粒可誘導(dǎo)假體周圍骨細胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達顯著增加，LC-3I向 LC-3II轉(zhuǎn)換明顯。以上研究結(jié)果表明骨細胞自噬調(diào)節(jié)正常與病理性骨代謝。同時我們還發(fā)現(xiàn)顱頂局部注射自噬特異性抑制劑3-MA能明顯促進TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細胞損傷，增加骨細胞凋亡，提示自噬也參與了TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細胞損傷。

綜上，TCP磨損顆粒可通過激活自噬和凋亡誘導(dǎo)假體周圍骨細胞損傷，促進假體周骨溶解和關(guān)節(jié)無菌性松動。但是，TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細胞自噬是否與氧化應(yīng)激的發(fā)生有關(guān)，還需要以后進行深入地探討。

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