鄭艷青 史娜娜 曹存巍

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021;2.南寧市第四人民醫(yī)院，南寧 530023;3.廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021)

馬爾尼菲籃狀菌病 (talaromycosis marneffei，TSM)在東南亞、我國南方，尤其是廣西、廣東具有區(qū)域性流行[1]，TSM好發(fā)于免疫受損患者[2]，尤其是AIDS患者，據(jù)統(tǒng)計(jì)廣西19%的AIDS患者合并T.marneffei感染，是僅次于結(jié)核的第二大機(jī)會(huì)性感染[3]。值得注意的是，近年來TSM在未合并基礎(chǔ)疾病，細(xì)胞免疫功能未見異常的人群中發(fā)病數(shù)逐漸增多[4]。TSM病情隱匿，臨床表現(xiàn)錯(cuò)綜復(fù)雜，缺乏特征性，容易誤診和漏診，若不早期診斷和及時(shí)治療死亡率高 (超過80%)[5]。本研究組前期應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qPCR)技術(shù)，設(shè)計(jì)出具有高度特異性的T.marneffei引物和Taqman探針，建立了穩(wěn)定、高度特異、敏感、快速的檢測(cè)體系。在初步臨床檢測(cè)中，55例首次采集的血清樣本首次qPCR檢測(cè)呈陽性，與真菌培養(yǎng)結(jié)果一致性高達(dá)100%，耗時(shí)比真菌培養(yǎng)確診提前5～14 d，此方法有助于快速、特異性診斷TSM[6]。本研究基于前期研究結(jié)果，將臨床樣本擴(kuò)展到病理切片、活檢組織，期望從不同的臨床樣本中收集T.marneffei感染證據(jù)，為TSM的快速確診提供堅(jiān)實(shí)、可靠的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2017年1～6月期間，收集首次就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的5名HIV陰性TSM患者樣本，包括肩部、臀部、前額、手背病理切片樣本共5例，淋巴結(jié)活檢組織樣本1例?；颊呋厩闆r見表1。

1.2 方法

表1 TSM患者基本信息和臨床表現(xiàn)

注：/.無合并癥

1.2 方法

病理組織切片總DNA提取 將石蠟包埋的病理組織，切3～5薄片放入2 mL離心管中。加入1 200 μL二甲苯，渦旋震蕩，20 000 g離心5 min，移去上清。往沉淀加1 200 μL無水乙醇，輕柔地震蕩。20 000 g離心5 min，移去上清。重復(fù)用無水乙醇清洗1次。37℃開蓋孵育10～15 min，直到酒精蒸發(fā)干凈。加入180 μL的ATL緩沖液。按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)試劑盒說明書提取組織總DNA。

淋巴結(jié)組織總DNA提取 取疑似TSM患者病變淋巴結(jié)，于生物安全柜中研磨破碎組織，用200 μL Buffer ATL重懸，將勻漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)試劑盒說明書提取組織總DNA。

qPCR擴(kuò)增[6]引物和Taqman探針序列：見表2。

Real-time PCR反應(yīng)體系：2×Taqman universal PCR master mix 10 μL、5 μmol/L上下游引物和探針各1 μL，模板1～5 μL，無菌三蒸水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增體系：50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 1 min運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。設(shè)置已知濃度T.marneffeiDNA做陽性對(duì)照，白念珠菌DNA為陰性對(duì)照，反應(yīng)終點(diǎn)讀取達(dá)閾值熒光量的循環(huán)數(shù)

表2 qPCR 引物和探針序列

(Cq)。

2 結(jié) 果

上述實(shí)驗(yàn)操作至讀取結(jié)果所需時(shí)間為3～4 h。如表3所示，皮膚病理切片、淋巴結(jié)活檢組織qPCR檢測(cè)結(jié)果陽性。淋巴結(jié)活檢組織馬爾尼菲籃狀菌載量4.68×105copies，病理石蠟切片平均菌載量3.01×104copies (1.07×104～7.26×104copies)。

3 討 論

T.marneffei主要侵犯人體單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，可引起局限性感染和全身播散性感染，不同器官受累出現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)，主要以發(fā)熱，貧血，淺表及深部淋巴結(jié)腫大，肝臟和脾臟腫大，皮膚黏膜損害、溶骨性損害、呼吸道癥狀等為主，缺乏特異性[7]，導(dǎo)致TSM患者難以確診，耽誤早期治療。鄧卓霖等[8]報(bào)道TSM的病理改變與患者免疫狀態(tài)有關(guān)，免疫力強(qiáng)的患者病變局限，T.marneffei較少，表現(xiàn)為慢性肉芽腫炎；具有一定免疫力的患者，表現(xiàn)為化膿性炎；而免疫功能低下的患者，病變組織中無或極少淋巴細(xì)胞存在，布滿大量T.marneffei，表現(xiàn)為無反應(yīng)性壞死性炎癥，TSM患者臨床表現(xiàn)個(gè)體差異大，尤其是免疫功能未見異常的患者，其臨床表現(xiàn)不明顯，容易漏診、誤診。

表3TSM不同組織樣本中T.marneffei菌載量

Tab.3Loads ofTalaromycesmarneffeiin different samples of TSM cases

編號(hào)標(biāo)本來源Cq值總菌載量(copies)1左肩病理切片37．351．15×104右臂病理切片35．384．48×1042右上臀病理切片34．687．26×1043前額病理切片37．411．09×1044手背病理切片37．431．07×1045淋巴結(jié)活檢組織31．964．68×105

目前，臨床上診斷TSM以血標(biāo)本、骨髓、痰液、活檢組織等無菌樣本的真菌涂片和培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，病理學(xué)檢查、血清學(xué)檢測(cè)作為輔助診斷。TSM臨床特點(diǎn)和病理學(xué)特征與結(jié)核分枝桿菌、莢膜組織胞漿菌感染非常相似，難于辨別[8-9]，T.marneffei與莢膜組織胞漿菌在感染組織中的大小、形態(tài)相似，染色相同，需要進(jìn)行真菌培養(yǎng)才能鑒別。但是，真菌培養(yǎng)耗時(shí)長 (4～7 d)，不能滿足臨床快速診斷、早期治療的迫切需求[10]。

血清半乳甘露聚糖 (GM)試驗(yàn)作為TSM病廣泛的輔助診斷，具有便捷、快速、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，GM試驗(yàn)對(duì)PSM患者總體敏感度為78.38%，特異度為82.98%，但多種影響因素均可導(dǎo)致GM試驗(yàn)出現(xiàn)假陽性[11]。而T.marneffei未釋放入血或釋放入血后被迅速清除則會(huì)使GM試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性，導(dǎo)致漏診、誤診的情況。本研究旨在運(yùn)用多種檢測(cè)手段，從不同臨床樣本中收集T.marneffei感染證據(jù)，為臨床診斷提供依據(jù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，成為病原分子生物學(xué)研究的重要工具，qPCR已經(jīng)有效地運(yùn)用在結(jié)核分枝桿、HCV、HIV、曲霉菌等病原微生物的診斷[12]。實(shí)驗(yàn)組前期首次建立了qPCR診斷TSM的方法體系，該方法特異性為100%，靈敏度高，最低檢測(cè)限 (LOD)達(dá)到5～10拷貝數(shù)/反應(yīng)。并在前期初步運(yùn)用于臨床血清標(biāo)本的檢測(cè)，患者首次采集的血清檢測(cè)結(jié)果比真菌培養(yǎng)確診提前了5～14 d，并且能夠同時(shí)檢測(cè)活菌或者死菌，甚至是游離在在血清中T.marneffei的基因組DNA[6]。

Tsunemi等[13]首次在1例患者皮膚活檢組織中擴(kuò)增出T.marneffei。Hanxiang Zeng等[14]運(yùn)用巢式PCR成功檢測(cè)出患者皮膚、肺組織石蠟切片中的T.marneffei。本實(shí)驗(yàn)收集TSM患者皮損病理切片或病變淋巴結(jié)組織，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，準(zhǔn)確地檢測(cè)出皮損切片和淋巴結(jié)活檢組織中T.marneffei載量，本實(shí)驗(yàn)方法具有快速、精確、定量、操作密閉性好的特點(diǎn)，直接檢測(cè)樣本中原始的菌載量，可直觀反應(yīng)病變組織遭受侵襲的嚴(yán)重程度。

有研究表明，TSM患者組織T.marneffei培養(yǎng)陽性率依次為：骨髓和淋巴結(jié) (100%)、皮疹組織 (90%)、血液 (76%)。并且皮疹組織及皮疹分泌物培養(yǎng)出T.marneffei的時(shí)間比血液、骨髓、痰液時(shí)間更短[15。由此可見，皮疹在診斷T.marneffei感染方面有陽性率高、用時(shí)短的特點(diǎn)。病變組織是病原菌集中的地方，相比血液更容易檢測(cè)到病原菌，適合用于早期分子診斷，為臨床診斷提供強(qiáng)有力的證據(jù)。本研究成功運(yùn)用qPCR檢測(cè)到皮損切片中的T.marneffei載量，但是制作病理切片耗時(shí)長，工序復(fù)雜，不能滿足臨床快速診斷的迫切需求。繼而本研究收集1例TSM患者淋巴結(jié)，直接提取組織DNA，qPCR檢測(cè)呈陽性，T.marneffei載量高達(dá)4.68×105copies。結(jié)合國內(nèi)外研究，qPCR直接測(cè)定活檢組織中的菌載量可作為快速診斷TSM的重要方法。課題組將進(jìn)一步對(duì)患者皮膚、淋巴、肺等活檢組織進(jìn)行研究，為臨床診斷TSM提供更多、更可靠的證據(jù)，為早期治療TSM爭取時(shí)間。

[1] Deng Z，Ribas JL，Gibson DW. Infections caused byPenicilliummarneffeiin China and Southeast Asia：review of eighteen published cases and report of four more Chinese cases[J]. Rev Infect Dis，1988，10：640-652.

[2] 葉楓，羅群，周瀅，等. 非HIV感染的馬爾尼菲青霉病2例報(bào)到并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J]. 中國真菌學(xué)雜志，2013，12，8(6)：342-347.

[3] 莊曉晟，梁伶，黃紹標(biāo)，等. 廣西壯族自治區(qū)馬爾尼菲青霉病 93 例臨床分析[J]. 臨床皮膚科雜志，2009，38(2)：342-346.

[4] Kawila R，Chaiwarith R，Supparatpinyo K. Clinical and laboratory characteristics of penicilliosis marneffei among patients with and without HIV infection in Northern Thailand：a retrospective study[J]. BMC Infect Dis，2013，5(13)：464.

[5] Chan JF，Lau SK，Yue KY，et al.Talaromyces(Penicillium)marneffeiinfection in non-HIV-infected patients[J]. Emerg Microbes Infect，2016，5：e19.

[6] 莫冬冬. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷馬爾尼菲青霉病方法的建立以及其初步評(píng)價(jià)[D]. 南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[7] Yanyin OY，Shuangqi C，Cunwei C，et al. Administration of voriconazole in disseminatedTalaromyces(Penicillium)marneffeiinfection：a retrospective study[J]. Mycopathologia，2017，182(5-6)：569-575.

[8] 鄧卓霖，馬韻. 酷似組織胞漿菌病的馬爾尼菲青霉病[J]. 中華病理學(xué)雜志，1999，28(5)：348-349.

[9] 朱倫，何燕，余波，等. 腸道莢膜組織胞漿菌病2例臨床病理觀察[J].診斷病理學(xué)雜志，2013，20(9)：549-552.

[10] 陳陽霞，席麗艷. 馬爾尼菲青霉病診斷研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用皮膚病學(xué)雜志，2014，7(1)：31-33.

[11] 嚴(yán)汝帆，李鑫壘，曹存巍，等. 血清半乳甘露聚糖試驗(yàn)在診斷馬爾尼菲青霉病中的應(yīng)用[J]. 中國真菌學(xué)雜志，2016，2，11(1)：16-19.

[12] 劉小榮，張?bào)遥跤缕? 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)的理論研究及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(2)：329-332.

[13] Tsunemi Y，Takahashi T，Tamaki T.Penicilliummarneffeiinfection diagnosed by polymerase chain reaction from the skin specimen[J]. J Am Acad Dermatol,2003, 49(2)：344-346.

[14] Hanxiang Z，Xiqing L，Liyan X，et al. Identification ofPenicilliummarneffeiin paraffin-embedded tissue using nested PCR[J]. Mycopathologia，2009，168：31-35.

[15] 張建全，楊美玲，鐘小寧，等. 人免疫缺陷病毒抗體陰性與陽性者播散性馬爾尼菲青霉菌病的臨床及實(shí)驗(yàn)室特征[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31(10)：740-746.