飼料中總膽堿含量的測定

叢明日，牛軍艦

（青島中維安全檢測有限公司，山東青島 266000）

飼料中的總膽堿以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的形式存在，結(jié)合態(tài)膽堿主要來源于飼料本身，游離態(tài)膽堿主要來自添加的飼料級的氯化膽堿[1]。目前的國標(biāo)方法NY/T1819[2]采用離子色譜法，但離子色譜儀比較貴，一般實(shí)驗(yàn)室通常配置的都是可見——紫外分光光度計(jì)，國標(biāo)GB/T 17481[3]的分光度光度法只能檢測預(yù)混料中的氯化膽堿，無法滿足飼料中的總膽堿的檢測。筆者結(jié)合嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定的方法[4]，用1mol/L的HCl溶液水解過夜提取，甲醇低溫沉淀雜質(zhì)，過濾后濃縮，在低溫下加入雷氏鹽溶液，生成膽堿雷氏鹽的結(jié)晶，再進(jìn)行分光光度法測定。

1 測定的方法原理、儀器設(shè)備、試劑和測定步驟

1.1 方法原理

膽堿用1mol/L的HCl溶液提取后，在低溫下加入雷氏鹽生成膽堿雷氏鹽的結(jié)晶，用丙酮溶解，定容，將其丙酮溶液在波長520nm下進(jìn)行分光光度測定。

1.2 試劑

甲醇（分析純，國藥集團(tuán)）；正丙醇（分析純，國藥集團(tuán)）；5%雷氏鹽（分析純，國藥集團(tuán)）甲醇溶液：稱取5g雷氏鹽溶于甲醇，加甲醇稀釋至100mL，混勻，置冰箱內(nèi)保存；1mol/L HCl（分析純，國藥集團(tuán)）溶液：90ml濃HCl加入到990ml的水中，混勻，放棕色瓶中保存；丙酮（分析純，西隴化工）；氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)品（純品，Sigma）。

1.3 儀器設(shè)備

RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（江蘇天由有限公司）；UV mini-1240可見-紫外分光光度計(jì)（日本島津）；TDL-5離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB204-S電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

1.4 測定步驟

1.4.1 提取 精確稱取試樣約5g入250mL錐形瓶中，加入50mL1mol/L的鹽酸溶液，放在70℃的水浴中過夜震蕩，冷卻后用水轉(zhuǎn)移定容到100mL容量瓶，用濾紙過濾，得試樣提取液。移取50mL溶液于250ml燒杯，用濃NaOH（50%）溶液調(diào)pH到8～9，加50mL甲醇，在0℃冰箱放置過夜。過濾樣液于500mL平底燒瓶，用甲醇沖洗濾紙使濾液轉(zhuǎn)移完全。于50℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮到30ml左右，用水轉(zhuǎn)移到50ml離心管，放置冰箱0℃2h以上（保證溶液徹底冷卻），拿出后立即加入5ml 5%的雷氏鹽甲醇溶液，然后超聲震蕩使反應(yīng)液混合均勻，放入0℃冰箱過夜，以3000r/min離心10min，棄去上層溶液，加入 25ml水，以3000r/min離心5min，棄去上層溶液，加入15ml正丙醇，然后超聲1~2min混勻后以3000r/min離心5min，棄去上層溶液，加入15ml正丙醇，以3000r/min離心5min，棄去上層溶液，用氮?dú)鈱⒊恋硗耆蹈伞?/p>

1.4.2 試樣的測定 向沉淀準(zhǔn)確加入10ml丙酮，超聲搖勻樣液。離心5min，轉(zhuǎn)速為3000r/min，取上層清液，用有機(jī)濾頭過濾至1.0cm比色皿中，以丙酮作參比，在520nm波長下，用分光光度計(jì)測定吸光度，在工作曲線上查得試樣中氯化膽堿的含量。同時(shí)做空白。

1.4.3 工作曲線的繪制 將氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)品盛于稱量瓶中于103℃烘干，置于干燥器中冷卻至室溫。準(zhǔn)確稱取2g（精確至0.0001g）于100mL容量瓶中，加水溶解后用水定容至刻度，搖勻。精密移取10ml于100ml容量瓶中，用水定容搖勻。分別移取 0.5mL，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml溶液于 50ml離心管中，加水補(bǔ)足到15ml，放置冰箱0℃2h以上（保證溶液徹底冷卻），拿出后立即加入5ml5%的雷氏鹽甲醇溶液，震蕩使反應(yīng)液混合均勻，放入0℃冰箱過夜，以3000r/min離心10min。棄去上層溶液，加入25ml水，以3000r/min離心5min，棄去上層溶液，加入10ml正丙醇，然后超聲1～2min混勻，以3000r/min離心5min，棄去上層溶液，加入10ml正丙醇，以3000r/min離心5min，棄去上層溶液，用氮?dú)鈱⒊恋硗耆蹈桑凑?.4.2測量各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制工作曲線。

1.5 測定結(jié)果的計(jì)算

從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得測定時(shí)所取試樣液中氯化膽堿的含量，再根據(jù)稱樣量和稀釋倍數(shù)計(jì)算出樣品的含量。

2 結(jié)果和討論

2.1 線性方程和相關(guān)系數(shù)

以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在0.1g/L~1.2 g/L濃度范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程為Y=0.5442X+0.0077，相關(guān)系數(shù) R=0.9992。

2.2 方法的精密度實(shí)驗(yàn)

分別對三種飼料產(chǎn)品進(jìn)行了6次實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果，如表1。

表1 三種飼料產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

三種不同的樣品的檢測結(jié)果的RSD均小于5%，說明方法的重復(fù)性可以達(dá)到檢測的要求。

2.3 方法的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2g樣品，加入2g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，進(jìn)行檢測計(jì)算加標(biāo)回收率。根據(jù)樣品的含量計(jì)算本底值為2.23mg，扣除本底，計(jì)算回收率，如表2。

6次加標(biāo)回收率均大于95%，提取比較完全，準(zhǔn)確結(jié)果比較準(zhǔn)確。

2.4 pH值的選擇

將提取液調(diào)到不同的pH，最后通過檢測結(jié)果確認(rèn)膽堿穩(wěn)定的最佳pH范圍，根據(jù)表3的數(shù)據(jù)確認(rèn)，最佳的pH范圍為8~9。

表2 加標(biāo)回收率

表3 pH值范圍運(yùn)算

表4 不同時(shí)間沉淀效果

2.5 凈化時(shí)間的選擇

采用加入甲醇放到冰箱中，對蛋白、淀粉等雜質(zhì)進(jìn)行沉淀凈化后，再過濾掉雜質(zhì)。時(shí)間過長會影響實(shí)驗(yàn)效率，時(shí)間過短會影響凈化效果，通過表4中不同的時(shí)間沉淀效果，確認(rèn)沉淀所選的最少時(shí)間為2h。

3 結(jié)論

該方法穩(wěn)定，提取比較完全，達(dá)到95%以上，檢測結(jié)果比較可靠，只是用到一般實(shí)驗(yàn)室都有的可見——紫外分光光度計(jì)，成本低，同時(shí)具有較好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，可以代替離子色譜法，能廣泛應(yīng)用于各類飼料中總膽堿的含量檢測。

[1]王吉峰.飼料中的膽堿[J].飼料工業(yè),1997,18(04):16

[2]NY/T 1819-2009.飼料中膽堿的測定 離子色譜法[S].

[3]GB/T 17481-2008.預(yù)混料中氯化膽堿的測定[S].

[4]GB 5413.20-2013.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定[S].