陳奇　徐彬　毛建文

【摘要】目的 觀察SD大鼠血清外泌體對(duì)乳腺癌（MCF-7）細(xì)胞自噬的影響。方法 將MCF-7細(xì)胞分為正常對(duì)照組、雷帕霉素組、外泌體組及聯(lián)合給藥組，外泌體組為加入10%（v/v）外泌體培養(yǎng)48 h，雷帕霉素組為加入雷帕霉素（30 nM）作用24 h，聯(lián)合給藥組為加入10%（v/v）外泌體培養(yǎng)48 h后，再加入雷帕霉素（30 nM）作用24 h，正常對(duì)照組僅使用10% DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。采用CCK-8法檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞的存活率；熒光顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞LC3B蛋白的熒光強(qiáng)度；Western blotting法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞LC3B。結(jié)果 4組細(xì)胞的存活率無(wú)顯著性差異，MCF-7細(xì)胞LC3B2/LC3B1比值分別為1.317±0.430、2.308±1.085、0.808±0.350、1.110±0.496。外泌體組與雷帕霉素組有顯著性差異；聯(lián)合給藥組與雷帕霉素組也有顯著性差異。結(jié)論 大鼠血清外泌體能減少M(fèi)CF-7細(xì)胞的自噬現(xiàn)象。

【關(guān)鍵詞】外泌體；MCF-7細(xì)胞；細(xì)胞自噬

【中圖分類號(hào)】R737.9 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2018.07..02

1963年，比利時(shí)的細(xì)胞學(xué)家克里斯汀德迪夫率先提出了一個(gè)術(shù)語(yǔ)“自噬”，即一種由細(xì)胞自身調(diào)控的毀滅機(jī)制，用來(lái)降解無(wú)用或功能失調(diào)的組份[1]。大隅良典于90年代闡明了細(xì)胞自噬的機(jī)制，研究者們直至此時(shí)才發(fā)現(xiàn)自噬在人體中的重要作用[2]。外泌體是一種細(xì)胞來(lái)源的囊泡，存在于許多乃至所有真核生物的體液中，包括血液、尿液以及細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液中[3-4]。幾乎所有類型的細(xì)胞都通過(guò)自噬克服饑餓、回收養(yǎng)分以及將多余的或有害的成分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外。同時(shí)外泌體能夠在細(xì)胞間傳遞，因此在某些情況下這一轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是通過(guò)外泌體進(jìn)行的[5]。目前關(guān)于血清外泌體的研究大多集中于作為新的生物標(biāo)志物用于活體檢驗(yàn)方面，對(duì)于血清外泌體與腫瘤及自噬之間的研究較少。本研究觀察了大鼠正常血清外泌體對(duì)乳腺癌（MCF-7）細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7；高糖DMEM培養(yǎng)基；四季青胎牛血清；胰島素（Sigma公司）；胰酶；雷帕霉素（Rapamycin）；CCK-8試劑盒、LC3B抗體、GAPDH抗體、鼠抗、兔抗（碧云天公司）；脫脂奶粉

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及血清外泌體提取及鑒定

MCF-7細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液（含10 %胎牛血清、

0.01 mg/ml胰島素）培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

取1 ml正常SD大鼠血清，試劑盒法提取，用PBS重懸至

200 μl，加入DMEM（含10%FBS）培養(yǎng)液，配置成每100 μl培養(yǎng)液含10 μl外泌體，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。對(duì)所提取的血清外泌體采用透射電鏡檢測(cè)其形態(tài)特征，采用WB法鑒定特征性蛋白質(zhì)。

1.3 血清外泌體對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的影響觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，PBS洗3次，用0.25%的胰酶消化，按4×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為Control、雷帕霉素（Rapa）、外泌體（Exo）、Exo+Rapa組，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。Control組不加任何藥物培養(yǎng)；Rapa組加入30nM Rapa，作用24 h；Exo組加入過(guò)濾后的含10%外泌體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h；Exo+Rapa組先加入含10%外泌體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，然后加入30 nM Rapa，作用

24 h。處理結(jié)束后使用CCK-8試劑盒，孵育1 h，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）。取3孔OD值的平均值。

1.4 MCF-7細(xì)胞LC3B的熒光檢測(cè)

細(xì)胞分組同1.3。吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，固定

15 min。去除固定液，洗滌后加入封閉液，37℃下封閉

1 h。加入LC3B抗體（1：100）4℃孵育過(guò)夜，移除抗體洗滌后加入綠色DyLight 488熒光二抗，37℃孵育1 h，洗滌后加入DAPI染核，加入抗熒光淬滅劑，封片。用熒光顯微鏡觀察，在相同曝光時(shí)間下拍照。

1.5 MCF-7細(xì)胞LC3B蛋白檢測(cè)

細(xì)胞分組同1.3。采用Western blotting法，提取MCF-7細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜2 h，5%奶粉室溫封閉2 h，TBS/T洗滌后加入一抗（LC3B，1：1000；GAPDH，1：1000）4℃孵育過(guò)夜。洗滌后加入相應(yīng)二抗，37℃孵育1 h。使用ECL進(jìn)行顯影，用Image J分析軟件定量分析目的條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以“x±s”表示，行t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體的分離鑒定

血清外泌體在透射電鏡下呈茶托樣、雙分子層結(jié)構(gòu)。Western blotting法結(jié)果顯示，試劑盒提取的血清外泌體具有標(biāo)志性的CD63及HSP70蛋白。

2.2 MCF-7細(xì)胞存活率的比較

Control、Rapa、Exo及Exo+Rapa組的OD值分別為0.367±0.043、0.345±0.031、0.650±0.051、0.420±0.020。結(jié)果顯示，雷帕霉素對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定影響，但抑制作用并不明顯，血清外泌體則明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖。

2.3 MCF-7細(xì)胞LC3B表達(dá)的熒光結(jié)果比較

如圖1所示，顆粒狀綠色熒光為自噬標(biāo)志性蛋白LC3B。Control組中，MCF-7細(xì)胞有少量的自噬現(xiàn)象；Rapa組中，由于加入自噬誘導(dǎo)劑，細(xì)胞的自噬顯著增多；而Exo組的細(xì)胞自噬現(xiàn)象與正常對(duì)照組相比更少，幾乎無(wú)自噬現(xiàn)象；至于Exo+Rapa組的細(xì)胞則與Control組相類似。

2.4 MCF-7細(xì)胞中LC3B的相對(duì)表達(dá)量比較

LC3B 2與LC3B 1比值的大小通常用于估計(jì)自噬水平的高低，比值越大則自噬水平越高。Control、Rapamycin、Exo、Exo+Rapa組LC3B2/LC3B1的比值分別為1.317±0.430、2.308±1.085、0.808±0.350、1.110±0.496。結(jié)果顯示，Exo組與Rapa組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Exo+Rapa組與Rapa組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。外泌體能夠降低MCF-7細(xì)胞的自噬且能抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬。見表2。

3 討 論

乳腺癌時(shí)至今日仍是發(fā)展中國(guó)家女性癌癥死亡的主要原因，在發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率亦居高不下[6]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是一種重要的信號(hào)分子，參與細(xì)胞通訊，在免疫應(yīng)答和腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用[7]?，F(xiàn)階段的研究大多集中于腫瘤分泌的外泌體對(duì)癌癥的發(fā)展[8]、轉(zhuǎn)移[9，10]、化學(xué)耐藥[11]等多方面的影響。對(duì)于血清外泌體的研究則多為生物標(biāo)志物[12]，其對(duì)腫瘤會(huì)產(chǎn)生何種影響仍未可知。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清外泌體能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的自噬。而自噬與癌癥緊密相關(guān)，并在腫瘤中起雙重作用，能夠抑制腫瘤發(fā)生但對(duì)腫瘤生長(zhǎng)又有著促進(jìn)作用[13-16]。那么血清外泌體是否能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的自噬，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)呢，其抑制自噬的機(jī)制又是什么，以及血清外泌體是怎樣從血液進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞中的？這些問(wèn)題值得進(jìn)一步深入的探討?？偠灾?，本研究的發(fā)現(xiàn)，為抑制腫瘤生長(zhǎng)提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)，為血清外泌體的功能研究開拓了新的方向。

參考文獻(xiàn)

[1] D.J.Klionsky，Autophagy revisited：a conversation with Christian de Duve[J]. Autophagy.2008，4（6）：740-3.

[2] J. M.M.Levy，C. G.Towers， A. Thorburn， Targeting autophagy in cancer[J]. Nat Rev Cancer.2017，17（9）：528-542.

[3] S.Keller，M.P.Sanderson， A. Stoeck，et al.Exosomes： from biogenesis and secretion to biological function[J].Immunol Lett.2006，107（2）：102-8.

[4] E.van der Pol，A.N.Boing，P.Harrison，et al.，Classification， functions， and clinical relevance of extracellular vesicles[J].Pharmacol Rev.2012，64（3）：676-705.

[5] F. Baixauli，C.Lopez-Otin，M.Mittelbrunn， Exosomes and autophagy： coordinated mechanisms for the maintenance of cellular fitness[J]. Front Immunol. 2014， 5（403.

[6] L. A.Torre，F(xiàn).Bray，R. L.Siegel，et al.，Global cancer statistics， 2012[J]. CA Cancer J Clin.2015，65（2）：87-108.

[7] L. Murrow，R.Malhotra，J.Debnath，ATG12-ATG3 interacts with Alix to promote basal autophagic flux and late endosome function[J]. Nat Cell Biol.2015，17（3）：300-10.

[8] Y.L.Hsu，J.Y.Hung，W.A.Chang， et al.， Hypoxic Lung-Cancer-Derived Extracellular Vesicle MicroRNA-103a Increases the Oncogenic Effects of Macrophages by Targeting PTEN[J].Mol Ther.2018，26（2）：568-581.

[9] W. Zhou，M.Y.Fong，Y.Min， et al.，Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis[J].Cancer Cell. 2014， 25（4）： 501-15.

[10] A. Hoshino， B. Costa-Silva，T.L.Shen， et al.， Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis[J]. Nature.2015，527（7578）：329-35.

[11] B.Y.Nabet，Y.Qiu，J. E.Shabason， et al.， Exosome RNA Unshielding Couples Stromal Activation to Pattern Recognition Receptor Signaling in Cancer[J].Cell.2017，170（2）：352-366.

[12] K. G.Ronquist， G.Ronquist.A.Larsson， et al.， Proteomic analysis of prostate cancer metastasis-derived prostasomes[J].Anticancer Res.2010，30（2）： 285-90.

[13] E. White，Deconvoluting the context-dependent role for autophagy in cancer[J]. Nat Rev Cancer.2012，12（6）：401-10.

[14] A. F.Fernandez， C.Lopez-Otin，The functional and pathologic relevance of autophagy proteases[J]. J Clin Invest.2015，125（1）：33-41.

[15] D. Herranz，A. Ambesi-Impiombato，J. Sudderth， et al.， Metabolic reprogramming induces resistance to anti-NOTCH1 therapies in T cell acute lymphoblastic leukemia[J]. Nat Med.2015，21（10）：1182-9.

[16] C. M.Sousa， D. E. Biancur，X.Wang， et al.Pancreatic stellate cells support tumour metabolism through autophagic alanine secretion[J].Nature.2016，536（7617）：479-83.

本文編輯：吳宏艷