寧偉澤，徐軍

北京市中關(guān)村中學(xué)，100000

云南的金花普洱作為普洱茶中的珍貴種類，在我國已有千年歷史[1]。金花普洱是普洱茶中的極品，用傳統(tǒng)工藝制成的普洱茶，除偶爾出現(xiàn)“金花”外，還無法做到人為控制“金花菌”在普洱茶中的增殖。近來以改良工藝制備的“金花普洱緊壓茶”是用云南大葉種茶為原料，經(jīng)二次發(fā)酵制作而成，不僅茶多酚含量高，而且外觀有大量金色炫目的“金花”點(diǎn)綴，非常獨(dú)特[2]?！敖鸹ā泵耖g稱“金花菌”，學(xué)名叫“冠突散囊菌”，是對(duì)人體有益的酵素類菌，能分泌多種胞外酶催化茶葉化合物的轉(zhuǎn)化，改善茶葉品質(zhì)，并被認(rèn)為具有強(qiáng)身健體、消食降脂、降糖抗氧化和防癌抗癌作用，而受到茶葉愛好者和研究者的關(guān)注[3]。

近來出現(xiàn)的“金花普洱緊壓茶”中點(diǎn)綴的“金花”就是“冠突散囊菌”嗎？它的大量增殖會(huì)對(duì)普洱茶發(fā)酵的微生物菌群有何影響？

傳統(tǒng)的微生物菌株鑒定和群落結(jié)構(gòu)分析方法主要依靠選擇性培養(yǎng)基計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)及生理生化檢測，這些研究方法存在分析不完整和鑒定不準(zhǔn)確的問題[4]。隨著第二代高通量測序手段的成熟，宏基因組分析可以提供豐富數(shù)據(jù)，從ITS和16sRNA擴(kuò)增子序列的聚類讀取，到全基因組所有結(jié)構(gòu)域分析，允許樣本無須培養(yǎng)，直接進(jìn)行測序分類[5-6]。ITS和16sRNA分別為真菌和細(xì)菌核糖體基因中的一部分，它具有種內(nèi)基因序列相對(duì)一致而種間差異較為明顯的特征，通過二代測序技術(shù)檢測，可以特異準(zhǔn)確系統(tǒng)全面地分析普洱金花菌緊壓茶中是否存在冠突散囊菌，以及其真菌和細(xì)菌的組成譜。研究結(jié)果不僅有助于推廣這一新的制茶工藝，而且將有益于全社會(huì)的健康事業(yè)。

一、材料與方法

1.樣品制備及建庫測序

金花普洱茶購于北京五方圣賢文化發(fā)展有限公司，5 g茶葉樣品用生理鹽水過濾，使用真菌DNA提取試劑盒提取對(duì)應(yīng)的DNA。使用PCR擴(kuò)增和TruSeq試劑盒構(gòu)建文庫，HiSeq2500進(jìn)行上機(jī)測序。

2.數(shù)據(jù)分析流程

（1）根據(jù)Barcode序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)。截去Barcode和引物序列后，使用FLASH對(duì)每個(gè)樣品的序列進(jìn)行拼接。參照Qiime，過濾處理得到高質(zhì)量的序列。對(duì)比數(shù)據(jù)庫Unite da-tabase，檢測并去除嵌合體序列。

（2）OTU聚類和物種注釋：利用Uparse軟件對(duì)序列進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%相似度將序列聚類成為OTUs（Operational taxonomic units）。比對(duì)Unit數(shù)據(jù)庫，對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，并分別在各個(gè)分類水平：phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

（3）香農(nóng)熵（Shannon entropy）可以評(píng)價(jià)物種多樣性程度，因此用于比較真菌和細(xì)菌在茶葉中豐度的多樣性。

3.統(tǒng)計(jì)分析

ITS和16s測序中香農(nóng)熵?cái)?shù)值比較應(yīng)用雙側(cè)T檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 17.0.

二、結(jié)果與分析

1.ITS測序闡述真菌菌群分布

將金花普洱茶分成3份，每1份茶葉分別提取DNA，進(jìn)行真菌的ITS二代測序。測序結(jié)果如表1所示，金花普洱茶中存在的真菌絕大多數(shù)屬于子囊菌門 （Ascomycota），散囊菌綱 （Eurotiomycetes），散囊菌目（Eurotiales），發(fā)菌科（Trichocomaceae），曲霉屬（Aspergillus）。在種水平，其中最高頻的OTU1（約99%）分別和4種真菌ITS區(qū)完全匹配，這4種真菌分別為：冠突曲霉（Asper?gilluscristatus，EF652078），肋狀曲霉 （Aspergillus?costiformis， HE615136）,謝瓦氏曲霉（Aspergillus?chevalieri，EF652068），謝瓦氏曲霉間型變種（As?pergillus intermedius，EF652074）。

2.16sRNA測序闡述細(xì)菌菌群分布

將金花普洱茶分成3份，每1份茶葉分別提取DNA，進(jìn)行細(xì)菌的16sRNA二代測序。測序結(jié)果如圖1所示，變型菌門（Proteobacteria）和后壁菌門（Firmicutes）占到了所鑒定菌群的三分之二，是最具有優(yōu)勢的菌門。γ-變型菌綱（Gammaproteobacteria）和桿菌綱（Bacilli）在所鑒定的菌群中占比也超過三分之二，是最具優(yōu)勢的菌綱。但是在細(xì)菌目水平，不同樣本間菌群構(gòu)成比差異較大，假單胞菌目（Pseudomonadales）和乳桿菌目（Lactobacillales）是最高頻菌目，但是其在不同樣本間的比例差異較大，其他菌目比例較低且在不同樣本間存在較大差異。在細(xì)菌科水平，3個(gè)樣本最具優(yōu)勢的菌科分別為假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）和腸桿菌科（Enterobacteriaceae），而且其所占比例在不同樣本間差異較大。假單胞菌屬（Pseudomo?nas）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、志賀氏菌屬（Shi?gella）和鹽單胞菌屬(Halomonas)是最具優(yōu)勢的菌屬，但在不同樣本中差異較大。

3.細(xì)菌和真菌多樣性比較

通過分析3份金花普洱茶的16sRNA和ITS測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在屬水平，細(xì)菌和真菌特異屬的中位數(shù)分別為94和47。為了從整體上評(píng)價(jià)金花普洱茶的細(xì)菌和真菌分布情況，分別計(jì)算了金花普洱茶細(xì)菌和真菌的香農(nóng)熵，其中細(xì)菌多樣性顯著高于真菌多樣性（P=0.001，雙側(cè)T檢驗(yàn)）（圖2）。

表1 金花普洱茶真菌分布豐度

圖1 3份金花普洱茶樣品最高頻的10種細(xì)菌

圖2 3份金花普洱茶中細(xì)菌和真菌平均香農(nóng)熵?cái)?shù)值比較

三、討論

本研究首次采用高通量二代測序的方法評(píng)價(jià)金花普洱茶真菌和細(xì)菌組成譜。ITS測序結(jié)果顯示金花普洱茶富含曲霉屬真菌，其他屬真菌含量極低。但曲霉屬中，最高頻的菌種可能為冠突曲霉（As?pergilluscristatus，EF652078）、肋狀曲霉 （Aspergil?luscostiformis， HE615136）、謝瓦氏曲霉 （Aspergil?luschevalieri，EF652068）、謝瓦氏曲霉間型變種（As?pergillus intermedius，EF652074）中的一種或幾種。16sRNA測序結(jié)果顯示金花普洱茶中假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、大腸桿菌屬（Escherichia-Shigella）和鹽單胞菌屬（Halomo?nas)是最具優(yōu)勢的菌屬，但是這幾種細(xì)菌在不同樣本中的比例差異較大，而且金花普洱茶中細(xì)菌種類及多樣性均顯著高于真菌的種類和多樣性。

“金花菌”的鑒定一直存在分歧，其中冠突散囊菌在2012年青霉和曲霉國際委員會(huì)（ICPA）大會(huì)上正式被命名為冠突曲霉[7]。傳統(tǒng)的微生物菌株鑒定和群落結(jié)構(gòu)分析方法主要依靠選擇性培養(yǎng)基計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)及生理生化檢測，這些研究方法存在分析不完整和鑒定不準(zhǔn)確的問題[4]。本研究采用高通量二代測序技術(shù)檢測真菌ITS基因序列，可以客觀系統(tǒng)地分析金花普洱茶中真菌組成譜。本研究結(jié)果顯示，該種方法制作出的金花普洱茶富含曲霉屬真菌，但僅靠ITS測序無法最終確定最高頻的真菌為冠突曲霉，后續(xù)還需聯(lián)合β‐微管蛋白基因（BenA）、鈣調(diào)蛋白基因（CaM）及RNA聚合酶II基因（RPB2）序列對(duì)上述4種真菌進(jìn)行全面鑒定。但是由于金花普洱茶中絕大多數(shù)為曲霉屬真菌，除冠突散囊菌外，其他和冠突散囊菌ITS區(qū)測序序列一致的3種真菌不會(huì)顯著抑制其他真菌的生長，因此金花普洱茶中最高豐度的真菌極有可能為冠突散囊菌。金花普洱茶中真菌組成譜呈現(xiàn)寡克隆性生長模式，曲霉屬真菌占據(jù)真菌組成譜中的99%，而且真菌物種多樣性顯著低于相應(yīng)細(xì)菌多樣性，這可能是由于冠突散囊菌顯著抑制其他屬真菌生長造成的。

雖然變形菌綱（Gammaproteobacteria）和桿菌綱（Bacilli）是金花普洱茶中最具優(yōu)勢的菌綱而且占比超過三分之二，但是在目、科和屬水平上，金花普洱茶的菌群分布差異較大。

綜上所述，金花普洱茶中富含曲霉屬真菌，極有可能為冠突散囊菌；同時(shí)富含假單胞菌屬，乳酸菌屬、大腸桿菌屬和鹽單胞菌屬等細(xì)菌，其中細(xì)菌物種多樣性超過真菌。

參考文獻(xiàn)

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[3]黃婧,楊民和.茯磚茶中“金花”菌的研究進(jìn)展及應(yīng)用潛力[J].福建茶葉,2013(1):7-12.

[4]馬燕,趙明,周玲,等.普洱茶樣中“金花”微生物的分離鑒定[J].茶葉通訊,2011,38(2):17-20.

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[6]Qin J,Li R,Raes J,et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature,2010,464(7285):59-65.

[7]Hubka V,Kolarik M,Kubatova A,et al.Taxonomic revision of Eurotium and transfer of species to Aspergillus[J].Mycologia,2013,105(4):912-937.