劉復生

（河南省中牟縣動物疫病預防控制中心，中牟 451450）

片形吸蟲屬于片形科、片形屬，該病呈世界性廣泛分布，是一種對牛羊、駱駝等反芻動物和人類危害嚴重的人畜共患性寄生蟲病之一［1］。據(jù)相關報道，全球約有7億經(jīng)濟動物感染片形吸蟲，給相關養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失；此外，近些年來關于人感染片形吸蟲病的報道也較多，在被調(diào)查的60余個國家與地區(qū)中，約200萬人感染有片形吸蟲病，其中我國云南宜賓縣也有關于暴發(fā)片形吸蟲病感染人類的報道［2-3］。河南省是我國奶牛主要養(yǎng)殖地區(qū)，為了促進奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，本次研究通過對中牟縣奶牛進行片形吸蟲病流行學調(diào)查，對片形吸蟲線粒體nad1基因進行擴增與分析，鑒定該地區(qū)片形吸蟲的種類，為該病的進一步防制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

此次研究所調(diào)查的4個奶牛場分別來自河南省中牟縣韓寺鎮(zhèn)、萬灘鎮(zhèn)、白沙鎮(zhèn)、大孟鎮(zhèn)，從每個奶牛場中隨機抽選60份新鮮糞便樣品，共240份，每份樣品50 g左右，分別標記后置于封口袋，待檢。

1.2 蟲卵形態(tài)學鑒定

分別從每個封口袋中取出糞便40 g左右，利用尼龍袋集卵法收集蟲卵，吸取沉渣后在光學顯微鏡下檢測，并參考相關文獻，進行初步形態(tài)學鑒定［4］。

1.3 PCR擴增

對獲得的片形吸蟲蟲卵進行分子生物學鑒定，用Omega生物技術公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取絳蚴蟲的DNA基因組，以PCR技術對蟲卵線粒體nad1基因序列進行擴增，通過序列分析對蟲卵進行分子學鑒定。其中引物利用宋慧群等［5］設計的引物，上游引物F：5’-AGATTCGTAAGGGGCCTAATA-3’（21 bp），下游引物 R：5’-ACCACTAACTAATTCACT TTC-3’（21 bp），引物委托上海生工生物技術有限公司合成。采用25 μL 擴增體系：ddH2O 13.75 μL，MgCl24 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0μL，上下游引物（50 pmol/L）各 0.25 μL，DNA聚合酶 0.25μL，模板DNA 2μL，混勻后低速離心，并作空白對照。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性 30 s，50℃退火 30s，72℃延伸 30 s，35 個循環(huán)，72℃后延伸5 min。取5μL擴增產(chǎn)物進行1.0%凝膠電泳，將陽性樣品回收后送至上海生工生物技術服務有限公司測序。

1.4 nad1基因序列測定和序列分析

將所獲得的樣品測序結果用DNAStar 5.0軟件分析，并從GenBankTM上搜索現(xiàn)有的片形吸蟲nad1基因序列，進行同源性比較。以豬蛔蟲（Ascaris suum）作為外群，利用Clustal X1.8及Mega 4.1程序中的鄰接法（Neighbor-joiningmethod，NJ）繪制種系發(fā)育樹。鄰接法在軟件默認設置下進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同地區(qū)奶牛片形吸蟲流行學調(diào)查結果

通過對不同地區(qū)共240份奶牛糞便樣品的檢測，結果發(fā)現(xiàn)：共有13份樣品檢測為陽性，陽性率5.41%；韓寺鎮(zhèn)、萬灘鎮(zhèn)、白沙鎮(zhèn)、大孟鎮(zhèn)4個鎮(zhèn)奶牛場奶牛片形吸蟲感染率分別為5.0%、3.30%、6.67%和6.67%。詳見表1。

表1 不同地區(qū)奶牛片形吸蟲流行學調(diào)查結果

2.2 不同發(fā)育階段奶牛片形吸蟲流行學調(diào)查結果

通過分析不同生長階段奶牛群感染片形吸蟲病的特點，發(fā)現(xiàn)各生長階段奶牛群都可以感染片形吸蟲，其中以1歲以下的犢牛感染率最低，為3.12%；2歲以上的成年牛的感染率最高，為6.50%；1～2歲的奶牛感染率居中，為4.71%。詳見表2。

表2 不同年齡奶牛片形吸蟲流行學調(diào)查結果

2.3 PCR擴增結果

13個片形吸蟲樣品成功擴增出約440 bp的片段，與預期片形吸蟲nad1目的片段大小相符，未出現(xiàn)非特異性條帶，且空白對照為陰性，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。

圖1 片形吸蟲線粒體線粒體nad1基因序列PCR擴增產(chǎn)物電泳分析

2.4 測序與序列分析結果

測序結果顯示，13個片形吸蟲樣品均成功擴增出nad1基因片段，大小基本一致，為442～446 bp，通過與GenBank中所收錄的片形吸蟲相關的nad1序列（EF612491.1、EF612492.1、EF612494.1 與 EF612496.1）進行同源性對比。結果發(fā)現(xiàn)：1個片形吸蟲樣品檢測為肝片吸蟲，12個樣品檢測為大片吸蟲，其中肝片吸蟲分離株nad1序列與GenBank中收錄的肝片吸蟲（EF612494.1和EF612496.1）同源性分別為98.7%和99.3%，12個大片吸蟲分離株nad1與GenBank中收錄的大片吸蟲（EF612491.1和EF612492.1）同源性分別為98.6%～99.3%和99.2%～99.8%。使用Mega 4.1軟件的鄰位相連法（Neighbor-Joining，NJ）構建序列的種系發(fā)育樹（圖2），通過種系發(fā)育分析，結果顯示，12個片形吸蟲分離株與GenBank中收錄的大片吸蟲（EF612491.1和EF612492.1）位于同一大分支，1個片形吸蟲分離株與GenBank中收錄的肝片吸蟲（EF612494.1和EF612496.1）位于同一大分支，得到了很好的鑒別。詳見圖2。

圖2 基于nad1基因序列所構建的自展一致樹

3 討論

本次調(diào)查結果顯示，中牟縣奶牛片形吸蟲病感染率5.41%，調(diào)查結果明顯低于湘東地區(qū)奶牛片形吸蟲病感染率（21.43%）［5］，但高于廣西地區(qū)奶牛片形吸蟲病感染率（0）［6］，這說明不同地區(qū)奶牛片形吸蟲流行情況差異較大。通過分析不同生長發(fā)育階段奶牛群片形吸蟲病感染情況，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1歲以下犢牛的感染率最低，為3.12%，而1～2歲和2歲以上奶牛群感染率偏高，分別為4.71%和6.50%。

為了明確中牟縣奶牛片形吸蟲的種類，本次研究在對研究所獲得的13個片形吸蟲樣品分離株進行了nad1基因序列擴增與分析，進行準確的分子鑒定。結果顯示，擴增所得到的13個片形吸蟲樣品分離株線粒體nad1基因序列長度基本一致，為442～446 bp，其中肝片吸蟲分離株nad1序列與GenBank中收錄的肝片吸蟲（EF612494.1和EF612496.1）同源性分別為98.7%和99.3%，12個大片吸蟲分離株nad1與GenBank中收錄的大片吸蟲（EF612491.1和EF612492.1）同源性分別為98.6%～99.3%和99.2%～99.8%，可以初步確定中牟縣奶牛片形吸蟲種類主要為肝片吸蟲和大片吸蟲，其中大片吸蟲為優(yōu)勢蟲種，通過構建系統(tǒng)種系發(fā)育樹也確定了這一結果。本次研究對中牟縣乃至河南省奶牛片形吸蟲病的診斷和防制及進一步分子學研究奠定了堅實的基礎。

［1］ 陳芳玲，任佳麗，盧秀紅，等.間接ELISA檢測百色地區(qū)牛片形吸蟲感染情況［J］.廣西畜牧獸醫(yī)，2015，31（2）：84-86.

［2］ Valero M A，Perez-CrespoI，Periago M V，et al.Fluke egg characteristics for the diagnosisof human and animal fascioliasis by Fasciola hepatica and F.gigantica［J］.Acta Trop，2009，111（2）：50-159．

［3］ 顧偉，蘇慧勇，鄒靜，等.云南省首次暴發(fā)巨片形吸蟲感染的臨床診治分析［J］.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2012，30（6）：455-459.

［4］ 汪明.獸醫(yī)寄生蟲學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：226-234.

［5］ 何德肆，胡述光，歐陽敘向，等.湘東地區(qū)五個奶牛場寄生蟲病感染情況調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)寄生蟲病，2004，12（1）：11-14.

［6］ 韋志峰，覃勇，陸以全，等.廣西水牛和奶牛寄生蟲感染情況的調(diào)查［J］.中國畜禽種業(yè)，2015（4）：3-5.