趙吳靜，董書偉，倪春霞，武中庸，侯 曉，才讓卓瑪，蒲萬霞

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院新獸藥工程重點開放實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050；2.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州 730030）

乳房炎是奶牛養(yǎng)殖場中的高發(fā)病之一，該病易反復(fù)，對奶牛生長發(fā)育以及產(chǎn)品質(zhì)量影響較大，甚至?xí)鼓膛适a(chǎn)性能而造成巨大損失［1］。金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）可產(chǎn)生溶血毒素、腸毒素、血漿凝固酶、耐熱核酸酶等毒素，引起急性、慢性和亞臨床性（隱性乳房炎）乳房炎；也可引起化膿性感染、食物中毒、牛乳房炎、仔豬滲出性皮炎等疾病，其致病性強(qiáng)，危害性大，分離率不斷上升［2-7］。近年來，由于抗生素的不合理使用，耐藥金黃色葡萄球菌的感染率和分離率也不斷增加。李光超等［8］采用微量肉湯稀釋法測定其對7種藥物的敏感性，結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌對磷霉素最為敏感，而對紅霉素、氨芐西林和克林霉素具有較強(qiáng)的耐藥性。王華等［9］對兔源金黃色葡萄球菌進(jìn)行了藥敏性試驗，結(jié)果顯示，分離株對氨芐西林、青霉素高度敏感，對利福平、氟苯尼考、慶大霉素、氧氟沙星中度敏感，對頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、土霉素等耐藥。王秋東等［10］采用微量肉湯稀釋法對分離自內(nèi)蒙古部分地區(qū)規(guī)?；膛龅?4株金黃色葡萄球菌進(jìn)行了藥敏試驗，結(jié)果表明，分離株對林可霉素、青霉素、環(huán)丙沙星、苯唑西林、紅霉素、卡那霉素、四環(huán)素、頭孢噻呋耐藥，對萬古霉素、泰妙菌素、沃尼妙林及氟苯尼考敏感。疫苗被認(rèn)為是預(yù)防和治療奶牛乳房炎最有效的手段，但疫苗研制的前提是必須清楚了解感染地區(qū)流行菌株的基因型特性［11］。DNA 隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)是一種簡便、快速、靈敏可行的遺傳標(biāo)記技術(shù)，目前該技術(shù)被普遍用于對微生物進(jìn)行基因分型與鑒定［12-13］。筆者等對分離于上海和內(nèi)蒙古地區(qū)的金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗，確定其藥物敏感性，以指導(dǎo)臨床用藥；同時采用RAPD技術(shù)對分離自我國內(nèi)蒙古和上海兩個地區(qū)的引起奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌進(jìn)行基因分型，分析其分子流行病學(xué)特點，以期為奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌疫苗的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品及標(biāo)準(zhǔn)菌株

臨床型乳房炎奶樣采于內(nèi)蒙古和上海地區(qū)的規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC2246購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；表皮葡萄球菌作為陰性菌株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院新獸藥工程重點開放實驗室分離鑒定。

1.2 試劑與儀器

DNA Ladder Marker、蛋白酶 K、溶菌酶、Premix EX Taq酶，均來自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌染色體DNA提取試劑盒（離心柱型），來自TIANGEN生物制品公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)；選用OXOID的氟哌酸、復(fù)方新諾明、左氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、青霉素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、萬古霉素、四環(huán)素和先鋒霉素V藥敏紙片，直徑為5mm；Applied Biosystems PCR擴(kuò)增儀、DYY-8C型高壓電泳儀、VITEK-2 COMPACT全自動微生物生化鑒定儀。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化 搖勻奶樣，吸取200μL均勻涂布于血瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取大而凸起、表面光滑、濕潤呈金黃或白色、周圍有溶血圈的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，涂片、革蘭氏染色、鏡檢，對具有葡萄串狀的分離菌進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定、金黃色葡萄球菌16S rRNA PCR鑒定及特異性基因——耐熱核酸酶基因nuc種屬鑒定。1.3.2 生化鑒定 根據(jù)鏡檢結(jié)果，采用VITEK-2全自動微生物生化鑒定儀鑒定。

1.3.3 16S rRNA鑒定在無菌條件下，挑取純培養(yǎng)單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20～24 h。按天根基因組提取試劑盒的步驟提取細(xì)菌基因組DNA。利用細(xì)菌16S rRNA通用引物，并結(jié)合金黃色葡萄球菌特異性基因——耐熱核酸酶基因nuc進(jìn)行種屬鑒定，引物序列信息見表1。

表1 鑒定金黃色葡萄球菌PCR引物

1.3.4 藥敏試驗 采用K-B紙片擴(kuò)散法，選用“1.2”項中13種藥敏片進(jìn)行藥敏試驗，分別將菌株接種于5mL的MH液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20～24 h，取200μL菌液均勻涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)20～24 h取出，用游標(biāo)卡尺測量各菌抑菌圈直徑，最后計算平均值，按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》判斷受試菌對藥物的敏感性。

1.3.5 菌株RAPD分型 在無菌條件下，挑取純培養(yǎng)單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃孵育20～24 h。按細(xì)菌DNA提取試劑盒操作。獲得的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)文獻(xiàn)［14］選擇序列 4M：5′-AAGACGCCGT-3′作為擴(kuò)增引物。采用25μL反應(yīng)體系，體系參數(shù)為：Premix混合液12.5μL，DNA模板2μL，引物2μL，去離子水8.5μL。PCR循環(huán)參數(shù)分別為94℃5min，37℃5min，72℃5min，循環(huán) 4次；94℃ 1min，37 ℃ 1min，72 ℃ 2min，循環(huán) 30次；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，后用Quantity One 1-D成像系統(tǒng)紫外成像。電泳圖像采用BioNumerics軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，具體參數(shù)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)如下：最適值為0.5%，位置公差為1.25%，閾值為80%。圖像采用Dice相關(guān)系數(shù)和非加權(quán)組算術(shù)平均法UPGMA（Unweighted pair groupmethod with arithmeticmean）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生化鑒定及16S rRNA鑒定

2.1.1 菌株的生化鑒定 VITEK-2鑒定顯示有91株被鑒定為金黃色葡萄球菌。

2.1.2 16S rRNA鑒定通過細(xì)菌16SrRNA通用引物，并結(jié)合金黃色葡萄球菌特異性基因——耐熱核酸酶基因nuc進(jìn)行種屬鑒定。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增的16S rRNA基因片段及nuc基因片段與對照菌目的基因擴(kuò)增長度相符。將預(yù)定基因進(jìn)行測序并用NCBIBlast在線軟件比對分析，有91株菌株被鑒定為金黃色葡萄球菌，與生化鑒定結(jié)果一致。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

內(nèi)蒙古地區(qū)臨床型乳房炎金黃色葡萄球菌分離株對先鋒霉素V、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左氟沙星均高度敏感，對萬古霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明和青霉素均耐藥；上海地區(qū)臨床型乳房炎金黃色葡萄球菌分離株對左氟沙星和環(huán)丙沙星均高度敏感，對氯霉素、氧氟沙星、青霉素、紅霉素、阿莫西林、慶大霉素、四環(huán)素和萬古霉素均耐藥。兩個地區(qū)分離菌均對喹諾酮類抗生素高度敏感，說明此類抗生素對兩個地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用（表2）。

表2 內(nèi)蒙古和上海地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌藥敏試驗結(jié)果mm

2.3 菌株RAPD分型

2.3.1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果 對分離鑒定出的91株金黃色葡萄球菌和1株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌CVCC2246基因組DNA模板進(jìn)行隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增，由擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果可知，除第76株外，所有菌株基因組DNA經(jīng)擴(kuò)增后均產(chǎn)生了清晰、可分辨的帶譜，擴(kuò)增產(chǎn)物在1～7條帶之間，片段分子質(zhì)量大小在400～4 500 bp之間，具有多種帶型（圖1）。

圖1 92株金黃色葡萄球菌RAPD-PCR擴(kuò)增條帶

圖2 92株金黃色葡萄球菌RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的遺傳聚類圖

2.3.2 遺傳相關(guān)性分析 聚類分析親緣關(guān)系樹狀圖（圖2）顯示，菌株共分為12個基因型，其中1型5株（5.5%），2型 6株 （6.6%），3型 15株 （16.5%），4型 10株（11.0%），5型 13株（14.3%），6型、9型和 12型各 2株（2.2%），7型8株（8.8%），8型24株（26.4%），10型 3株（3.3%），11型僅1株（1.1%）。8型菌株占總菌株數(shù)的26.4%，為主要流行的優(yōu)勢菌群。

3 討論

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的隱患之一，也是影響奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一，因此，加強(qiáng)對奶牛乳房炎的診斷和防治尤為重要［15］。引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一是金黃色葡萄球菌，具有高傳染性和難治愈等特性［16-17］。本研究對從內(nèi)蒙古和上海地區(qū)分離鑒定的91株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏紙片試驗，結(jié)果顯示內(nèi)蒙古地區(qū)和上海地區(qū)分離金黃色葡萄球菌均呈現(xiàn)多重耐藥性，但耐藥的抗生素種類有所不同，上海地區(qū)分離菌的耐藥情況比內(nèi)蒙古地區(qū)嚴(yán)重，這可能與地區(qū)用藥種類、用藥方法和劑量及菌株生長環(huán)境不同有關(guān)。

金黃色葡萄球菌易對抗生素產(chǎn)生多重耐藥性［18-19］，使得其藥物治愈率不佳，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，從分子基因水平上研究金黃色葡萄球菌越來越受到人們重視［20］。由于各地區(qū)環(huán)境不同，養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理水平參差不齊，導(dǎo)致引起奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌差異較大，給疾病防治帶來了諸多困難。為了解不同地區(qū)金黃色葡萄球菌的基因型特征，需對分離自奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌進(jìn)行基因分型，尤其是對引發(fā)局部地區(qū)感染的致病性金黃色葡萄球菌進(jìn)行基因分型，對實現(xiàn)奶牛乳房炎病原菌有效溯源和控制感染源具有重要意義。

RAPD是一種采用通用的隨機(jī)引物對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，再利用擴(kuò)增產(chǎn)物指紋圖譜進(jìn)行基因分型的技術(shù)。國內(nèi)外學(xué)者均證實RAPD技術(shù)是一種應(yīng)用比較廣泛、靈敏、可行的分型方法。王琳等［21］對新疆地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌進(jìn)行RAPD基因分型，16株菌可分為2個類群。Kurlenda等［22］對234株金黃色葡萄球菌進(jìn)行RAPD分析，分為10個基因型。周長卿等［23］對青海地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌進(jìn)行RAPD基因型分析，可將21株金黃色葡萄球菌分為3個聚類群。于丹等［24］對北京地區(qū)奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌進(jìn)行RAPD基因分型，通過聚類分析，29株菌產(chǎn)生11個基因型。

本試驗采用隨機(jī)引物4M對分離自我國不同地區(qū)的91株金黃色葡萄球菌和1株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌基因組DNA模板進(jìn)行隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增，除第76株外，所有菌株基因組DNA經(jīng)擴(kuò)增后均產(chǎn)生了清晰、可分辨的帶譜，可清晰反映菌株間的基因多態(tài)性特征。兩個地區(qū)中，內(nèi)蒙古地區(qū)主要集中于2、5型和8型，占其總菌數(shù)的61.8%。內(nèi)蒙古地區(qū)菌株分布較廣，但其余各基因型所占菌株數(shù)較少，可能為內(nèi)蒙古地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)，病原菌容易發(fā)生地區(qū)間流行傳播。上海地區(qū)主要集中在3、4和8型，占其總菌數(shù)的64.3%。上海地區(qū)菌株分離于兩不同奶牛場，其中某牛場菌株基因型較集中，另一牛場菌株基因型分布較廣，這可能與牛場飼養(yǎng)管理水平等有關(guān)。

［1］ 王波.奶牛乳房炎的病因與防治［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2017（6）：73.

［2］ 趙吳靜，徐進(jìn)強(qiáng)，武中庸，等.苯唑西林敏感耐甲氧西林金黃色葡萄球菌研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（8）：2458-2464.

［3］ 王明月，郭昌明，王方.吉林省某豬場新發(fā)豬葡萄球菌引起的化膿性肺炎［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2016（9）：1577-1581.

［4］ 楊嵐，郝永清，何焱，等.金黃色葡萄球菌CP8-FnBPB-ClfA偶聯(lián)蛋白對金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的免疫效果研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2015，37（3）：229-232.

［5］ 岑靜，王賽，廖華媛，等.豬葡萄球菌的分離鑒定及其脫落素的研究［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2017（2）：212-216.

［6］ 高攀.新疆奶牛乳房炎病例中金黃色葡萄球菌耐藥性、血清型調(diào)查和乳頭灌注治療實驗［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［7］Botaro B G，Cortinhas C S，Dibbern A G，et al.Staph ylococus aureus intramammary infection afects milk yield and SCC of dairy cows［J］. Trop Anim Health Prod，2015，47（1）：61- 66.

［8］ 李光超，武小虎，馬友記，等.奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌耐藥基因型和表型的相關(guān)性分析 ［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（8）：1057-1064.

［9］ 王華，周孝瓊，吳小文，等.兔金黃色葡萄球菌病病原的分離鑒定及藥敏試驗［J］.中國獸醫(yī)雜志，2013，49（8）：30-31.

［10］王秋東，劉琪，董志民，等.內(nèi)蒙古部分地區(qū)致奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌和產(chǎn)色葡萄球菌的分子流行病學(xué)及耐藥性研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2017（4）：257-261.

［11］高潮，劉國慶，趙莉莉，等.上海地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌基因分型與耐藥性研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報，2014，32（1）：53-58.

［12］Elina R，Susana B，Cecilia F，et al.RAPD-PCR analysis of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine and human hosts［J］.Microbiol Res，2004，159：245-255.

［13］崔立云，張霄霄，楊毅梅.RAPD技術(shù)在寄生蟲分類和鑒定中的應(yīng)用［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2012，28（4）：375-379.

［14］張善瑞，王長法，高運(yùn)東，等.應(yīng)用PCR方法檢測奶牛乳房炎主要病原菌［J］.家畜生態(tài)學(xué)報，2007，28（4）：78-80.

［15］Le Marechal C，Thiery R，Vautor E，et al.Mastitis impact on technological properties ofmilk and quality ofmilk products-a review［J］.Dairy Sci Technol,2011，91：247-282.

［16］ Talbot B G，Lacase P.Progress in the development of mastitis vaccines［J］.Livestock Production Sci，2005，98（1-2）：101-113.

［17］楊峰，王旭榮，田永剛，等.牛源金黃色葡萄球菌感染小鼠后誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及其對藥物的抗性變化［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（12）：46-50.

［18］Ata NS，EL-Jakee，Nagwa S，et al.Antimicrobial resistance in clinical isolɑtes of Staphylococcus aureus from bovine and human sources in Egypt［J］.Glob Vet，2011，7（6）：581-586.

［19］Sabine P，Klaus O，Constanze W.Longitudinal study of the molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus at university hospital［J］.Journal of Clinical Microbiology，2006，44（12）：4297-4302.

［20］烏蘭巴特爾，郝永清，海巖，等.奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的分子流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國獸藥雜志，2007，41（2）：21-23.

［21］王琳，楊學(xué)云，王治才，等.奶牛乳房炎病例中金黃色葡萄球菌RAPD-PCR 基因分型的研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（11）：76-78.

［22］Kurlenda J，Grinholc M，Jasek K，et al.Rapd typing of methicillin-resist ant Staphylococcus aureus：A 7-year experience in a Polish hospital［J］.Med SciMonit，2007，13（6）：13-18.

［23］周長卿，王珂，胡俊杰，等.青海地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的基因型分析［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（2）：11-16.

［24］于丹，毛雙蘭，韓博.奶牛乳樣金黃色葡萄球菌的分離鑒定與RAPD分子分型研究［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2015（Z1）：369-370.