郭虹

（平?jīng)雎殬I(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅 平?jīng)?744000）

魏氏梭菌又稱產(chǎn)氣莢膜梭狀芽飽桿菌（Clostridium welchii），是由英國(guó)人Welchii和Nutall在1892年首先從一具腐敗的人類尸體產(chǎn)生氣泡的血管中分離得到，并以Welchii命名為魏氏梭菌。魏氏梭菌廣泛分布于自然界，常見于土壤、污水、飼料、食物和糞便，世界各地均有分布，也是腸道中常見菌之一，在一定條件下可引起嚴(yán)重疾病。目前發(fā)現(xiàn)的魏氏梭菌分為A，B，C，D和E五個(gè)型，菌體分泌的細(xì)菌毒素是引起人和動(dòng)物發(fā)病的關(guān)鍵因素。羊和牛魏氏梭菌感染較為常見，而且一旦感染死亡率較高，主要發(fā)生于羊的毒血癥，包括羊猝狙、羊腸毒血癥、羔羊痢疾等；該病病死率較高，動(dòng)物一旦感染，死亡率可達(dá)70%～100%，給我國(guó)的養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-3］。早期疫苗接種和快速準(zhǔn)確診斷是預(yù)防和早期治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著人類血漿蛋白組學(xué)的提出，以血漿蛋白組變化篩選生物標(biāo)記物為疾病早期診斷提供了強(qiáng)大的工具［4］。目前魏氏梭菌的診斷多以分子生物學(xué)診斷結(jié)合免疫學(xué)診斷為主，以蛋白組技術(shù)研究早期血漿蛋白變化尋找生物標(biāo)記分子尚鮮見報(bào)道。本文利用2-DE和質(zhì)譜技術(shù)研究早期感染魏氏梭菌綿羊血清蛋白變化，尋找有價(jià)值的蛋白質(zhì)分子，為魏氏梭菌早期診斷提供依據(jù)，也為疾病的預(yù)防和新型疫苗研發(fā)提出了新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

PROTEAN IEFCell等電聚焦系統(tǒng)、PROTEANⅡxi凝膠電泳系統(tǒng)、PDQUest 8.0圖像分析軟件系統(tǒng)、GS-800 Calibrated Densitometer凝膠掃描系統(tǒng)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；UV-1800紫外分光光度計(jì)為日本島津公司產(chǎn)品；17 cm非線性固相化梯度膠條（pH值3～10）、17 cm非線性固相化梯度膠條（pH值3～10）、IPG Buffer pH值3～10、2-D cleanup kit、礦物油、丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；CHAPS、甘氨酸、二硫蘇糖醇（DTT）和低熔點(diǎn)瓊脂糖、Tris、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸胺、硫尿、碘乙酰胺、考馬斯亮藍(lán)G-250、十二烷基硫酸鈉、牛血清白蛋白、尿素均為Sigma公司產(chǎn)品；羊魏氏梭菌檢測(cè)試劑盒；Album&IgG Depletion SpintrapTM為GE公司產(chǎn)品；其余藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 采樣綿羊來自甘肅某羊場(chǎng)，現(xiàn)場(chǎng)臨床診斷羊群精神沉郁，食欲廢絕，腹瀉，肌肉痙攣，倒地，四肢痙攣，角弓反張，有部分羊只死亡，而且發(fā)病到死亡病程較短，解剖病死羊只發(fā)現(xiàn)表面壞死；胸腔、腹腔、心臟等主要器官有大量積液；粘膜下組織常水腫；心內(nèi)外膜有點(diǎn)狀出血；腸道、肺的漿膜下可見出血，初步判定為魏氏梭菌感染，采集病情嚴(yán)重的綿羊血樣，用羊魏氏梭菌檢測(cè)試劑盒做進(jìn)一步確證，收集陰性和陽性血清若干份，-20℃保存。

1.2.2 2-DE樣品的制備 分別取檢測(cè)出陰陽性血清樣品，Bradford法定量，分裝保存。

1.2.3 2 -DE電泳和SDS-PAGE電泳 取樣品與350μL上樣緩沖液（7M 尿素，2M 硫脲，65MmDTT，4%CHAPS，0.2%（w/v）Bio-Lyte，痕量溴酚藍(lán)）混合，12 000×g，4℃離心5min。沿聚焦盤邊緣從左到右線性加入樣品，用鑷子輕輕剝?nèi)ソ鈨瞿z條的保護(hù)膜，分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤，膠條上覆蓋2～3mL礦物油。蓋上蓋子，設(shè)定等電聚焦程序。等電聚焦程序如下：50 V，12 h（主動(dòng)水化）；250 V（線性），30min；1 000 V（快速），1 h；9 000 V（線性），5 h；9 000 V（快速），6 8000 Vh；250 V（快速），5 h；任意時(shí)間［5］。

配制膠條平衡緩沖液（50Mm Tris-HCl pH值8.8、6M尿素、20%甘油、2%SDS），等電聚焦結(jié)束，將聚焦好的膠條分別置于6mL平衡A液（含2%DTT的平衡緩沖液）和6mL平衡B液（含2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液）中水平搖床上各平衡15 min，然后轉(zhuǎn)移膠條至12%的1mm SDS-PAGE膠上端進(jìn)行第二向垂直電泳，待溴酚藍(lán)距離板下沿1 cm左右停止電泳。

1.2.4 凝膠染色 40%的乙醇，10%的乙酸的固定液固定3 h以上；0.12%（w/v）的CBBG-250，10%的硫酸銨，10%的磷酸（v/v，85%的磷酸），20%的甲醇染色過夜；5%（m/v）硫酸銨，10%（v/v）甲醇脫色到背景清晰［6］。

1.2.5 圖像采集與分析及差異點(diǎn)的切取 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均重復(fù)3次以上，2-DE凝膠背景消除，點(diǎn)的匹配用PDQUest8.0軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用Excel2003。切膠筆切取差異蛋白點(diǎn)，去離子水沖洗干凈，保存在50%乙氰溶液中。

1.2.6 蛋白質(zhì)譜檢測(cè) 膠粒用乙氰脫色，測(cè)序級(jí)胰蛋白酶37℃酶解過夜，取酶解上清。微量離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀LCQ Deca Xp plus系統(tǒng)處理樣品，獲得的原始數(shù)據(jù)整合在質(zhì)譜儀上的Bioworks軟件中的檢索軟件SEQUEST搜索 NCBInr（National center for biotechnology information）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇的數(shù)據(jù)子庫(kù)為羊。其次，檢索結(jié)果輸出后，采用 Single threshold（Xcorr分別為 1.9，2.2，3.75，相應(yīng)電荷數(shù)為+1，+2，+3）參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果進(jìn)行篩選，去除角蛋白污染，并對(duì)鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行最終確定。根據(jù)鑒定蛋白質(zhì)的FASTA格式序列文本，利用Compute p I/Mw Tool（http：//us.expasy.org/tools/pi_tool.html）計(jì)算每一個(gè)蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Albumin&IgG Depletion SpintrapTM試劑盒去除高豐度蛋白效果分析

由圖1可見，Albumin&IgG Depletion SpintrapTM試劑盒處理陰性和陽性血清樣品，SDS-PAGE電泳分析IgG和Albumin去除效果，比較處理前后電泳條帶發(fā)現(xiàn)，在150 kD左右及45 kD和66 kD之間局域處理后，樣品蛋白染色明顯變淡，高豐度蛋白去除效果良好。

注：1.蛋白質(zhì)分子Marker；2.未處理的陰性血漿蛋白樣品；3.處理后的陰性血漿蛋白樣品；4.未處理的陽性血漿蛋白樣品；5.處理后的陽性血漿蛋白樣品。

2.2 健康綿羊與感染魏氏梭菌血漿蛋白2-DE圖譜比較分析

由圖2可知，2-DE凝膠經(jīng)過染色、脫色處理，背景清晰的圖片用PDQUest8.0軟件分析，通過凝膠背景消除，蛋白點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)及不同凝膠間蛋白點(diǎn)的匹配尋找到差異顯著的蛋白點(diǎn)10個(gè)。其中蛋白點(diǎn)1、2、3在陽性血清中高表達(dá)，蛋白點(diǎn) 4、5、6、7、8、9 只在陽性血清中表達(dá)，蛋白點(diǎn)9只在陰性血清表達(dá)，蛋白點(diǎn)10在陰性血清中高表達(dá)。

圖2 健康綿羊與感染魏氏梭菌綿羊血漿蛋白2-DE圖譜比較分析

2.3 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜結(jié)果

用干凈的槍頭切下差異蛋白點(diǎn)，乙腈脫色，測(cè)序級(jí)胰蛋白酶酶解，微量離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀LCQ Deca Xp plus系統(tǒng)處理樣品，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果如表1所示。

表1 質(zhì)譜鑒定的差異蛋白點(diǎn)

由表1可見，10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)全部成功分析得到5種蛋白質(zhì)，分別為轉(zhuǎn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白、血漿淀粉樣蛋白、免疫球蛋白和載脂蛋白，這些蛋白涉及機(jī)體脂肪代謝，應(yīng)激反應(yīng)以及免疫防御等功能。

3 討論

魏氏梭菌在醫(yī)學(xué)上是一類重要的梭菌，其病原體可引起人和動(dòng)物的一些疾病，包括氣性壞疽、食物中毒、嬰兒壞死性小腸結(jié)腸炎以及胃腸壞疽，嚴(yán)重影響人和動(dòng)物的食品衛(wèi)生安全［7-8］。在綿羊上，A型魏氏梭菌引起黃羔病，是一種罕見的小羊腸毒血癥，臨床癥狀表現(xiàn)為抑郁、貧血、黃疸以及血紅蛋白尿，尸檢發(fā)現(xiàn)組織蒼白，肝臟和脾臟變脆，膀胱中存有紅尿。本研究取感染A型魏氏梭菌綿羊血清，Albumin&IgG Depletion SpintrapTM試劑盒去除血液中高豐度蛋白白蛋白和免疫球蛋白，傳統(tǒng)的2-DE分離得到差異明顯的蛋白點(diǎn)10個(gè)，質(zhì)譜成功鑒定出5種蛋白質(zhì)，蛋白點(diǎn)1、2、3和蛋白點(diǎn)4、5，以及蛋白點(diǎn)6、7、8分別只鑒定出同一種蛋白質(zhì)，這是由于蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用引起的。這些蛋白涉及機(jī)體脂肪代謝，應(yīng)激反應(yīng)以及免疫防御等功能。研究這些蛋白功能有助于深入了解魏氏梭菌感染機(jī)體的機(jī)理，為尋求新的疾病預(yù)防及治療措施奠定基礎(chǔ)。

［1］ 孟霞，孫翠平，唐娜，等.一株山羊魏氏梭菌的分離鑒定及其致病性研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42（7）：1905-1909.

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［5］ 王建鋒，趙興緒，張勇，等.健康奶牛與臨床型乳腺炎奶牛乳腺核蛋白組差異表達(dá)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（1）：105-111.

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