張清霞 張迎 何玲玲 陳夕軍 童蘊(yùn)慧 紀(jì)兆林

由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻紋枯病是一種世界性病害，在世界各主要水稻產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生且危害嚴(yán)重。近年來(lái)，隨著矮稈多蘗品種的推廣，水稻密集型栽培方式的采用，以及氮肥施用量的不斷增加，紋枯病的危害逐年加重，在我國(guó)各稻區(qū)已經(jīng)成為最嚴(yán)重的水稻病害之一。目前，對(duì)于該病害的防治主要是以化學(xué)防治為主，但隨著近年來(lái)該病害發(fā)生的不斷加重，對(duì)于藥劑的使用量也逐年增加，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留日趨嚴(yán)重[1]。盡管井岡霉素對(duì)紋枯病防治效果較好，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期使用在田間也發(fā)現(xiàn)了抗藥性菌株[2]。因此，尋找安全有效的防治技術(shù)和方法迫在眉睫。生物防治具有對(duì)人畜安全、對(duì)環(huán)境壓力小、不易誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，有的生防菌還可以促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，因而具有廣闊的發(fā)展前景。

許多微生物對(duì)水稻紋枯病菌有較強(qiáng)的拮抗能力，如鏈霉菌(Streptomyces)[3]、禾長(zhǎng)蠕孢菌(Helminthosporium gramineum)[4]、假紫色色桿菌(Chromobacterium pseudoviolaceum)[5]、芽孢桿菌(Bacillus)[6]、假單胞菌(Pseudomonas)和木霉(Trichoderma)[7]等。不同微生物對(duì)水紋枯病菌作用機(jī)制差異明顯。Duan等[4]用禾長(zhǎng)蠕孢產(chǎn)生的粗毒蛇孢假殼素來(lái)防治水稻紋枯病，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)能明顯減輕水稻紋枯病，而且對(duì)水稻的生長(zhǎng)無(wú)任何副作用，亦不影響產(chǎn)量和品質(zhì)。稠李鏈霉菌JAU4234對(duì)水稻紋枯病菌作用機(jī)制是抑制菌絲生長(zhǎng)、抑制致病因子表達(dá)和蛋白質(zhì)合成[3]。陳思宇報(bào)道熒光假單胞菌XF-174對(duì)水稻紋枯病的盆栽和田間小區(qū)防效均為40%以上，該細(xì)菌主要產(chǎn)生蛋白酶、嗜鐵素、赤霉素等次生代謝產(chǎn)物，不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和吲哚乙酸[8]。

已報(bào)道的生防細(xì)菌中，假單胞菌由于其獨(dú)特的種群優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用其防治植物病害已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。假單胞菌屬細(xì)菌是植物根際土壤微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)微生物種群之一，具有分布廣、數(shù)量多、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、繁殖快、競(jìng)爭(zhēng)定殖力強(qiáng)的特點(diǎn)[9]。而在眾多的假單胞屬細(xì)菌中分離得到最多且研究比較深入的有綠針假單胞菌(P.chlororaphis)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)以及銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)。其作用機(jī)制主要產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物包括抗生素吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，PCA)、2,4-二乙酰基間苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol，PHL)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin，PRN)、藤黃綠膿菌素(pyoluterorin，PLT)、假單胞菌酸(pseudomonic acid)、氫氰酸和植物生長(zhǎng)素吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，揮發(fā)性有機(jī)化合物如3-羥基-2-丁酮及2R，3R-丁二醇等[10-11]。在水稻紋枯病生物防治中，利用生防細(xì)菌抑制病原物侵染提高植物抗病能力是一條有效途徑。為挖掘更多的生防資源，我們從實(shí)驗(yàn)室保存的生防菌中篩選對(duì)水稻紋枯病防病效果強(qiáng)的拮抗細(xì)菌，通過(guò)16S rDNA序列分析和生理生化性狀測(cè)定，明確菌株7-5的分類地位，并對(duì)其可能的生防性狀進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻為紋枯病感病品種Lemont。供試細(xì)菌為 4-78、10-3、12-4、7-5、4-74、HTC-1、HTC-5、W10，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。其中，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)W10是本實(shí)驗(yàn)室保存的一株抑菌譜廣、對(duì)多種植物病害都有較好防病效果的生防細(xì)菌，本研究中以該細(xì)菌作為參照菌株。

供試真菌包括病原真菌水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

所用試劑TaqDNA聚合酶、dNTP，購(gòu)于TaKaRa公司；2,4-二乙?；g苯三酚、乙酰丙酮銅和4,4’-對(duì)二甲氨基二苯基甲烷由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)張力群教授饋贈(zèng)；藤黃綠膿菌素和吩嗪-1-羧酸純品由上海交通大學(xué)張雪洪教授饋贈(zèng)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

所用培養(yǎng)基包括金氏B培養(yǎng)基[12]、幾丁質(zhì)酶檢測(cè)培養(yǎng)基[13]、蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基[14]、纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基[15]、嗜鐵素檢測(cè)培養(yǎng)基[16]、PPM培養(yǎng)基[17]。

1.2 苗期防病試驗(yàn)

參考陳夕軍[18]的方法略作修改。將水稻紋枯病感病品種Lemont種子經(jīng)1%雙氧水浸泡1 d后，再用清水浸泡2 d左右，浸種溫度為30℃。待絕大多數(shù)種子發(fā)芽后分別播于直徑20 cm的塑料盆中，每盆栽種10粒種子，待水稻長(zhǎng)成4葉1心時(shí)接種，去除大于4葉和小于3葉的植株，各重復(fù)均保留7株苗。采用牙簽嵌入法接種。將火柴棒剪成0.8～1.0 cm長(zhǎng)后劈分為二，每個(gè)PDA培養(yǎng)皿稱放1.5 g火柴棒并浸濕，滅菌后接種紋枯病病菌，培養(yǎng)3 d后可用于接種。將新活化的供試生防細(xì)菌接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，在28℃搖床170 r/min下?lián)u培48 h后噴霧處理水稻，24 h后用鑷子將帶菌的火柴棒緊貼在植株基部，接種后移至溫室內(nèi)，再用塑料薄膜覆蓋保溫保濕，溫度和濕度分別控制在28℃和85%，接種后7 d測(cè)量病斑高度(最高病斑的上界距土表的高度)和植株高度(秧苗最高葉尖距土表的高度)，根據(jù)公式計(jì)算病級(jí)及防病效果，每處理3次重復(fù)。試驗(yàn)重復(fù)2次。

病級(jí)=病斑高度/苗挺高×9；

病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值)×100；

防治效果(%)=(對(duì)照組病情指數(shù)—處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100。

1.3 抑菌譜測(cè)定

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法略作修改。在PDA平板中央接種病原真菌菌碟(直徑0.5 cm)25℃培養(yǎng)1 d，在距離菌塊25 mm 處接種細(xì)菌懸浮液3 μL，置于25℃恒溫箱培養(yǎng)2～7 d測(cè)定抑菌帶寬。

1.4 菌株鑒定

采用CTAB/NaCl法提取菌株7-5的基因組DNA。采用16S rDNA保守引物16S-63F和16S-1387R[19]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:94℃下變性5 min，68℃下退火40 s，56℃下復(fù)性40 s，72℃下延伸10 min，循環(huán)35次;72℃下充分延伸10 min。引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。采用BLASTn程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索。用MEGA 5.05軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析(鄰接法)，并用Bootstrap軟件對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行1000次可信度分析。

依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的假單胞菌屬內(nèi)特征進(jìn)行生理生化鑒定[12]。

1.5 生防作用機(jī)制分析

1.5.1 拮抗細(xì)菌抗生素合成相關(guān)基因檢測(cè)及其鑒定

利用表1中引物phl2a/phl2b、PCA2a/PCA3b、prnCF/prnCR、pltcf/pltcr擴(kuò)增抗生素PHL、PCA、PRN和PLT合成基因簇對(duì)應(yīng)的片段，各個(gè)基因退火溫度見表1。其中熒光假單胞菌(P.fluorescens)FD6作為PHL、PLT和PRN陽(yáng)性對(duì)照以及PCA的陰性對(duì)照；熒光假單胞菌PAO1作為PCA陽(yáng)性對(duì)照；熒光假單胞菌2P24作為PLT、PCA和PRN的陰性對(duì)照，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將新鮮7-5細(xì)菌劃線接種到PDA平板上，置于28℃下培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)基切碎后轉(zhuǎn)移到100 mL三角瓶中，加入50 mL乙酸乙酯，將其放在37℃下振蕩90 min，室溫靜置5 min，收集上清，移到蒸餾瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用100 μL甲醇溶解，獲得PRN和PHL粗提物，抗生素展開劑為氯仿與丙酮混合物(19∶1);取單菌落置于5 mL金氏B培養(yǎng)液，在28℃下振蕩培養(yǎng)9 h，分別取2.5 mL懸浮液轉(zhuǎn)移到50 mL PPM培養(yǎng)液及金氏B培養(yǎng)液28℃下振蕩培養(yǎng)84 h。分別將細(xì)菌液8 000 r/min下離心10 min，收集上清液，用1 mol/L鹽酸酸化至pH 2.0，用0.4倍體積的乙酸乙酯萃取，連續(xù)振蕩10 min，收集乙酸乙酯相，真空抽干，用100 μL甲醇溶解，獲得PCA和PLT粗提物[17]。

表1 本研究所用引物Table 1.Primers used in this study.

1.5.2 拮抗細(xì)菌其他代謝產(chǎn)物檢測(cè)

氫氰酸的檢測(cè)：制氫氰酸敏感試紙，將新鮮的待測(cè)菌穿刺接種于盛有5mL固體金氏B培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)基上方懸掛小片氫氰酸敏感試紙，密封28℃培養(yǎng)48 h后觀察試紙顯色情況。

幾丁質(zhì)酶檢測(cè)[13]：在幾丁質(zhì)檢測(cè)平板上，將活化的待測(cè)菌穿刺接種于平板上。28℃培養(yǎng)3～7 d后測(cè)量菌落外圍透明圈的大小。

蛋白酶的檢測(cè)[14]：在蛋白酶檢測(cè)平板上，將已活化2 d的細(xì)菌接于培養(yǎng)基平板上。置于28℃下培養(yǎng)2 d，觀察菌落周圍的透明圈。

纖維素酶檢測(cè)[15]：在纖維素酶檢測(cè)平板上，將活化的待測(cè)菌穿刺接種于平板上。28℃下培養(yǎng)3～4d，用0.9%NaCl溶液清洗平板，每2 h除去NaCl溶液1次，沖洗并重新倒入新的NaCl溶液。6 h后觀察菌落周圍黃色暈圈并計(jì)算大小。

圖1 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻紋枯病的防治效果Fig.1.Control effects of antagonistic bacteria on rice sheath blight.

嗜鐵素的檢測(cè)[16]：在嗜鐵素檢測(cè)平板上，將活化的待測(cè)菌穿刺接種于平板上。28℃培養(yǎng)48 h后測(cè)量菌落外圍黃色暈圈的大小。

圖2 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性Fig.2.Inhibition abilities of antagonistic bacteria to R.solani.

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件DPS 6.55統(tǒng)計(jì)軟件中的LSD多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)水稻紋枯病的防效測(cè)定

溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照的病情指數(shù)為85.80，其次為HTC-5、10-3、12-4、HTC-1，病情指數(shù)分別為74.90、71.62、69.14、68.31，菌株7-5、4-74、4-78、W10病情指數(shù)較低，分別為26.34、25.27、21.85、20.99，可見菌株7-5、4-74、4-78與W10防病效果接近，防效均達(dá)到60%以上，且與對(duì)照差異極顯著。

2.2 抑菌譜測(cè)定

以供試的7種病原真菌為指示菌，檢測(cè)菌株7-5、4-74、4-78的抑菌譜。結(jié)果表明，4-74與4-78僅對(duì)水稻紋枯病菌有較強(qiáng)的抑菌能力，而菌株7-5的抑菌譜廣，對(duì)多種病原真菌均有不同程度的拮抗效果，尤其對(duì)水稻紋枯病菌和桃褐腐病菌拮抗能力最強(qiáng)，抑菌圈帶寬分別為1.27 cm和1.24 cm，其次是草莓灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌和油菜菌核病菌，抑菌圈帶寬分別為0.96、0.95、0.88和0.79 cm。因此，后續(xù)的研究主要圍繞菌株7-5開展。

2.3 菌株7-5的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段經(jīng)測(cè)序拼接后大小為1.3 kb。將獲得序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)分析，菌株7-5與所有的綠針假單胞菌(P.chlororaphis)屬細(xì)菌16S rDNA序列的相似性均為99%，系統(tǒng)進(jìn)化樹也聚成一簇(圖3)。

圖3 拮抗細(xì)菌7-5菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3.Phylogenetic tree based on 16S rDNAsequence homology of antagonistic bacteria strain 7-5.

菌株7-5菌體桿狀，菌落為黃色、光滑、邊緣整齊、稍凸起。革蘭氏染色陰性，能運(yùn)動(dòng)，不能水解淀粉，在4℃下可生長(zhǎng)，41℃下不能生長(zhǎng)，可產(chǎn)生能擴(kuò)散的色素，可液化明膠，氧化酶、脂酶、精氨酸雙水解酶均呈陽(yáng)性，反硝化反應(yīng)陰性。這些生理生化性狀符合綠針假單胞菌屬細(xì)菌特征。結(jié)合細(xì)菌16S rDNA序列分析結(jié)果，將其初步鑒定為綠針假單胞菌(P.chlororaphis)，序列登錄號(hào)為KY067439。

圖4 抗生素基因的PCR檢測(cè)Fig.4.PCR amplification of antibiotics gene from bacterial strain 7-5.

圖5 7-5產(chǎn)生抗生素的薄層層析鑒定Fig.5.Detection of antibiotics produced by strain 7-5 through TLC.

2.4 抗菌物質(zhì)的檢測(cè)

抗生素合成基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，菌株7-5基因組中可擴(kuò)增到720 bp的prn基因、750 bpphl基因、450 bpplt基因和1400 bppca基因，且4種抗生素的陽(yáng)性對(duì)照菌株均可擴(kuò)增到目的片段，而陰性對(duì)照菌株未檢測(cè)到，說(shuō)明該細(xì)菌可能產(chǎn)生硝吡咯菌素、吩嗪-1-羧酸，2,4-二乙?；g苯三酚和藤黃綠膿菌素(圖4)。以PHL、PLT和PCA純品為標(biāo)準(zhǔn)品，將提取的抗生素進(jìn)行薄層層析，層析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)綠針假單胞菌7-5可產(chǎn)生上述三種抗生素(圖5)。以熒光假單胞菌FD6產(chǎn)生的硝吡咯菌素作為參照進(jìn)行薄層層析，結(jié)果表明盡管7-5基因組含有720 bp的prnC基因，但并沒有檢測(cè)到該物質(zhì)（數(shù)據(jù)未顯示）。解淀粉芽胞桿菌W10基因組中均不能擴(kuò)增到上述四種抗生素合成相關(guān)基因。

2.5 拮抗細(xì)菌7-5的代謝分泌物

綠針假單胞菌7-5除產(chǎn)生多種抗生素以外，還可以產(chǎn)生氫氰酸和蛋白酶等抗菌代謝物，其中嗜鐵素黃色透明圈半徑僅為0.2 cm，而蛋白酶透明圈半徑為0.8 cm，不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和纖維素酶。

3 討論

近年來(lái)，隨著化學(xué)藥劑的大量使用，其不僅破壞生態(tài)環(huán)境，而且危害人類健康。因此，越來(lái)越多的科研工作者將研究方向轉(zhuǎn)向開發(fā)研制新型無(wú)毒副作用且綠色環(huán)保的生物農(nóng)藥。從許多植物根圍分離到的假單胞菌如綠針假單胞菌(P.chlororaphis)、P.protegens和熒光假單胞菌(P.fluorescens)抑菌譜廣，對(duì)植物病原真菌、細(xì)菌和線蟲都有拮抗能力[10]。P.chlororaphis7-5分離自內(nèi)蒙古黃瓜根圍土壤，研究結(jié)果表明該細(xì)菌作用譜廣，尤其對(duì)水稻紋枯病防病效果好，具有應(yīng)用前景。許多微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)真菌菌絲形態(tài)有明顯破壞作用。如P.chlororaphisCY02處理水稻稻瘟病菌后，導(dǎo)致分生孢子干癟畸形，菌絲腫脹，隔膜不清晰[22]。假紫色色桿菌的菌株發(fā)酵液處理紋枯菌菌絲后，菌絲變形扭曲，萎縮并局部腫脹[5]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)菌株7-5處理后的病菌菌絲形態(tài)未出現(xiàn)異常，說(shuō)明7-5對(duì)病原真菌的作用方式與CY02不同。

圖6 7-5產(chǎn)生代謝分泌物鑒定Fig.6.Assay of antifungal compounds produced by strain 7-5.

抗生素通常被認(rèn)為是假單胞菌產(chǎn)生的最重要抗菌物質(zhì)，在植物病害生物防治中起主導(dǎo)作用。如綠針假單胞菌Pcho10主要通過(guò)產(chǎn)生吩嗪-1-甲酰胺有效防治小麥赤霉病[23]；綠針假單胞菌PCL1606可以產(chǎn)生抗生素2-己基-5-丙基間苯二酚抑制許多土傳病原真菌生長(zhǎng)[24]。其中，有些菌株已開發(fā)為商用生防產(chǎn)品，如瑞士BioAgriAB公司研制的基于綠針假單胞菌的生防藥劑Cedomon，主要用于大麥和燕麥種子處理，可防治苗期多種真菌病害[25]；上海交通大學(xué)與上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司聯(lián)合研制的申嗪霉素，有效成分為吩嗪-1-羧酸，2011年已被中國(guó)農(nóng)業(yè)部登記為人工合成的生物殺菌劑，主要防治西瓜枯萎病和甜椒疫病[26]。本研究結(jié)果顯示，7-5也可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括吩嗪-1-羧酸，2,4-二乙?；g苯三酚和藤黃綠膿菌素、氫氰酸、嗜鐵素和蛋白酶，不產(chǎn)生纖維素酶和幾丁質(zhì)酶。而Nagarajkumar等[27]從水稻根際土壤中分離的熒光假單胞菌PfMDU2對(duì)紋枯病菌的拮抗活性與β-1,3-葡聚糖酶、水楊酸和氫氰酸的水平關(guān)系密切。2,4-二乙酰基間苯三酚、藤黃綠膿菌素和吩嗪-1-羧酸都是廣譜抗生素，對(duì)許多植物病原真菌、細(xì)菌都有抑菌活性。其中，藤黃綠膿菌素尤其對(duì)卵菌綱真菌引起的病害防病效果好。盡管這些抗生素已經(jīng)進(jìn)行多年研究，但人們對(duì)它們作用的機(jī)制并不完全清楚。Kwak等以Saccharomyces cerevisiae為指示菌，篩選對(duì)抗生素PHL敏感的缺失突變體文庫(kù)，研究結(jié)果證實(shí)PHL可影響細(xì)胞膜的功能、活性氧調(diào)控及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等多個(gè)基本的細(xì)胞進(jìn)程[28]。吩嗪抗生素是核黃素輔酶的類似物，它可抑制電子傳遞，并對(duì)許多動(dòng)物細(xì)胞有毒性作用。同時(shí)具有氫氧根離子的吩嗪可破壞類脂和其他一些高分子化合物。PCA可通過(guò)誘導(dǎo)Aspergillus fumigatus活性氧的產(chǎn)生，尤其是超O2－·、RNS和ONOO－，抑制真菌生長(zhǎng)[29]。菌株7-5可產(chǎn)生上述三種廣譜抗生素，究竟是單一抗生素抑制紋枯病菌還是三種抗生素復(fù)合起作用仍需進(jìn)一步研究。

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