陳申芝， 盧聰聰， 曹成全*， 童超， 葉超

(1. 樂山師范學(xué)院繼續(xù)教育學(xué)院，四川樂山614004； 2. 樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山614004； 3.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610101)

三葉蟲螢Emeiapseudosauteri隸屬于鞘翅目Coleoptera螢科Lampyridae峨眉螢屬Emeia，是2012年發(fā)現(xiàn)于四川省樂山市峨眉山的新種(Fuetal. ，2012)。目前對三葉蟲螢的研究非常少，在生物學(xué)研究方面，主要是三葉蟲螢生境分析與夜間活動規(guī)律(陳申芝等，2014)、不同環(huán)境和介質(zhì)對三葉蟲螢卵孵化的影響(盧聰聰?shù)龋?017)；在形態(tài)學(xué)研究方面，主要是在發(fā)表該新屬新種時描述了成蟲和5齡幼蟲的形態(tài)及其電鏡掃描照片(Fuetal. ，2012)。

三葉蟲螢在四川省樂山地區(qū)約3月中旬出現(xiàn)成蟲，其在景觀化開發(fā)上具有較大的價值(何華等，2011)。目前對昆蟲各個齡期幼蟲的研究很少，而對螢火蟲多是對成蟲的形態(tài)描述(付新華，2005；王余勇，2007；李學(xué)燕等，2008)?；谌~蟲螢人工繁育的長期研究，本文詳細描述了其各齡期幼蟲的外部形態(tài)特征，并初步研究了幼蟲的蛻皮行為。

1 材料與方法

1.1 三葉蟲螢卵的采集與孵化

在2016年4—6月三葉蟲螢產(chǎn)卵高峰期，于四川省樂山市綠心公園選擇三葉蟲螢種群數(shù)量分布均勻，且較平坦的草地和停耕農(nóng)田采集卵塊。將卵及卵的附著物(苔蘚、土壤等)一并鏟起，各卵塊單獨置于5 cm×5 cm×10 cm的塑料盒內(nèi)，保持卵塊附著物濕度約40%，平均溫度約20 ℃，空氣濕度約90%(盧聰聰?shù)龋?017)。每日記錄每盒孵化的幼蟲數(shù)量，用蘸濕的毛筆將幼蟲逐一挑出。

1.2 三葉蟲螢幼蟲的養(yǎng)殖

將同一天孵化出的幼蟲放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中養(yǎng)殖，噴水保持濾紙的濕度，并喂食蝸牛等食物(王余勇，2007；李學(xué)燕等，2008；盧聰聰?shù)龋?017)，次日清除殘渣和排泄物，保持清潔。當三葉蟲螢長到4齡時，將其放入含撕有缺口海綿的塑料養(yǎng)殖盒(長40 cm×寬20 cm×高60 cm)內(nèi)養(yǎng)殖，海綿底部鋪小石頭，注入水將石頭淹沒，并適時人工噴水(保持海綿濕度)及喂食，及時清除異物、換水等保持盒內(nèi)清潔，直至化蛹。保證每個齡期的試蟲數(shù)量不低于20只。

1.3 三葉蟲螢幼蟲的形態(tài)特征和生物學(xué)觀察

三葉蟲螢各齡期的幼蟲均用LY-WN超清顯微系統(tǒng)拍照，用電子游標卡尺測量體長、體寬。用Excel 2010統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。詳細記錄每次蛻皮過程中三葉蟲螢體色變化情況及特殊行為，利用攝像頭(?？低旸S-7908N-E4)全天攝像觀察，定期查看攝像內(nèi)容，分析其行為學(xué)特征。

1.4 三葉蟲螢?zāi)g幼蟲的電鏡掃描

將三葉蟲螢?zāi)g幼蟲的新鮮標本經(jīng)卡諾氏固定液(無水酒精∶ 冰醋酸=3∶ 1)固定12 h后，轉(zhuǎn)移至70%酒精中保存。在解剖鏡下，用解剖針和刀片將幼蟲的頭部、前胸、腹部末端等部位與蟲體剝離，進行鏡檢，再將各部分用超聲波清洗3次，每次30 s。依次放入80%、90%、95%、100%的酒精中梯度脫水各30 min，再用100%丙酮置換2次各30 min，然后置于醋酸異戊酯中30 min后更換1次。CO2臨界點干燥后，用雙面導(dǎo)電膠按不同角度將各結(jié)構(gòu)粘于樣品臺上，在真空噴涂儀內(nèi)噴金，在S-3400N掃描電子顯微鏡(Hitachi，日本)15 kV下觀察和拍照(Fuetal. ，2012；王娜等，2012)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉蟲螢各齡期幼蟲的形態(tài)特征

三葉蟲螢幼蟲共8齡，蛻皮7次；前胸、中胸、后胸背板均很發(fā)達，腹部9節(jié)，這些特征在整個幼蟲期都不會發(fā)生變化；幼蟲體型呈扁平狀，隨著齡期的增大，體色由淺褐色到黑色逐漸加深(圖1)。

2.1.1背面變化體表：1齡幼蟲初孵時體色透明，3～12 h后，體色逐漸加深，背面體色從背板中線向蟲體兩側(cè)由褐色逐漸變淡為淺褐色。2齡幼蟲體色較均勻，呈淡橘黃色，各體節(jié)連接處為乳白色，蟲體較1齡明顯變得厚實。3齡幼蟲體色由淺褐色和淡橘黃色不均勻交替分布，各體節(jié)顏色無明顯區(qū)別。4齡幼蟲體色為褐色，夾雜著淡橘黃色斑紋。自5齡幼蟲起，外骨骼逐漸變堅硬，體表凹凸不平，體色由深褐色加深至黑色。

剛毛：1齡、2齡幼蟲體表無剛毛，由清晰可見的多邊形紋路(圖2：A)組成。3齡幼蟲體表的多邊形紋路中間凹陷長出剛毛，呈白色須狀，較柔軟。從4齡幼蟲開始，體表毛孔逐漸隆起，于中心長出白色須狀剛毛(圖2：B)，直至密布全身。

背板邊緣(圖2：C)：1齡幼蟲體節(jié)邊緣形狀較圓鈍，各腹節(jié)連接緊密。2齡幼蟲體節(jié)邊緣向內(nèi)彎曲，排列相對寬松。3～7齡幼蟲邊緣鋸齒輪廓逐漸清晰，且前胸及中后胸背板兩側(cè)下緣呈尖角狀，尖角彎曲程度逐漸增大，腹部背板兩側(cè)向下呈彎鉤狀，尾節(jié)較圓鈍。8齡幼蟲各體節(jié)靈活，外緣尖角程度減小。

三角形斑紋(圖2：E)：將腹部背板中線兩側(cè)的對稱白色斑紋連接，呈三角形。低齡幼蟲的為淺褐色，1齡幼蟲最為明顯，隨著齡期增大，三角形斑紋由淺褐色逐漸變?yōu)楹谏?齡之后逐漸變得模糊，7齡之后則與體色相近。

背板中線(圖2：F)：1～3齡幼蟲的背板中線均為清晰的白色；自4齡起逐漸變?yōu)榛疑?齡為黑色，與體色相近。

特殊斑紋：1齡幼蟲各體節(jié)相接處體色較深，呈現(xiàn)深褐色梯形條紋(圖3：A)。2齡幼蟲頭部背板尖端、腹部第8節(jié)與尾節(jié)相接處顏色較深，呈現(xiàn)深褐色對稱斑紋(圖3：B)。3齡幼蟲白色背板中線兩側(cè)呈現(xiàn)較為對稱的淺褐色花瓣斑紋(圖3：C)。3、4齡幼蟲頭部背板中央顏色較深，呈現(xiàn)深褐色對稱斑紋。

圖1 三葉蟲螢各齡期幼蟲
Fig. 1 Different instars of the larvalEmeiapseudosauteri

羅馬數(shù)字表示齡期， A為背面， B為腹面

Roman numerals indicate the age， A indicates the dorsal view， and B indicates the ventral view

5齡幼蟲呈現(xiàn)橘黃色“八”字形條狀斑紋(圖3：D)，而6～8齡褐色“八”字形條狀斑紋逐漸消失。

2.1.2腹面變化頭部：隨著齡期增大，口器由淺褐色逐漸變?yōu)楹诤稚?。?齡幼蟲起，頭基部外殼呈三角形，逐漸變得厚實、堅硬，各角由圓鈍逐漸變得尖銳，顏色由褐色逐漸加深至黑色。各齡期觸角的部分節(jié)為透明色。

胸部和腹部：隨著齡期增大，顏色由淺褐色逐漸變?yōu)樯詈稚?，從?腹節(jié)至第8腹節(jié)顏色逐漸變淡。自1齡幼蟲起，腹部的斑紋逐漸發(fā)生變化，而且腹部兩側(cè)自4齡出現(xiàn)凹陷，兩側(cè)輪廓逐漸凸顯，中央逐漸隆起呈矩形。體表外骨骼逐漸變得厚實且堅硬。

足：由基節(jié)至跗節(jié)，顏色由褐色變?yōu)闇\褐色，基節(jié)輪廓較為明顯，顏色較深。自2齡幼蟲起，各足由淺褐色變?yōu)楹稚晒?jié)內(nèi)側(cè)1/2處出現(xiàn)1～4根淡橘黃色的刺，隨齡期增大，刺逐漸變長，且變得尖銳而粗壯，其中1根刺明顯較長(圖2：H)。8齡幼蟲部分刺已退化，僅余1～2根，較短。自3齡幼蟲起，脛節(jié)處出現(xiàn)的幾列橘黃色的刺逐漸變得尖銳且長而粗壯。隨著齡期增大，各足上的剛毛由白色變?yōu)榈冱S色，逐漸密集。

臀足：隨著齡期增大，臀足逐漸變長且加粗，基部顏色由淺褐色逐漸加深至深褐色。1齡幼蟲的臀足外殼柔軟、透明，顯微鏡下可見其內(nèi)部充盈的物質(zhì)(如脂肪粒)。自2齡幼蟲起，便可觀察到呈中空管狀的臀足腹內(nèi)側(cè)著生纖毛，隨齡期增大，纖毛逐漸密集，顏色由淡橘黃色逐漸變?yōu)樯詈稚?。幼蟲臀足分為左右對稱的兩部分，各7支，每部分包括著生在背外側(cè)的較長的5支和腹內(nèi)側(cè)較短的2支。自2齡幼蟲起，能清晰看見臀足，直至8齡，臀足逐漸變得粗大。

發(fā)光器：1齡幼蟲難以觀察發(fā)光器，夜晚僅發(fā)出微弱的亮點。2齡幼蟲可辨認出發(fā)光器，但比較模糊，發(fā)出較弱的光，第8腹節(jié)兩側(cè)發(fā)光器端點處著生2根橘黃色的刺。3齡和4齡幼蟲發(fā)光器仍比較模糊，著生刺的端點處逐漸隆起。5齡幼蟲的發(fā)光器清晰可見，為淺粉色。6～8齡幼蟲的發(fā)光器為白色米粒狀，逐漸隆起于體表，發(fā)光亮度遠大于低齡幼蟲，發(fā)光器下端著生的2根橘黃色刺逐漸變長且尖銳(圖2：I)。

剛毛：1齡和2齡幼蟲腹面尚未出現(xiàn)剛毛。自3齡幼蟲起，清晰可見黑色毛孔。4齡幼蟲出現(xiàn)隆起的白色毛孔，與隆起的黑色毛孔相間排布。直至8齡幼蟲，隆起的毛孔及剛毛排列越發(fā)密集(圖2：G)。

圖2 三葉蟲螢幼蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)標識Fig.2 Marked graphs of the morphology of the larval Emeia pseudosauteri

a.多邊形紋路， B. 背面剛毛， C. 背板邊緣， D. 臀足， E. 三角形斑紋， F. 背板中線， G. 腹面剛毛， H. 足股節(jié)刺， I. 發(fā)光器

a. polygonal grains， B. dorsal setae， C. the tergite edge， D. pygypodia， E. triangular patches， F. the tergite median， G. ventral setae， H. thorn on the femur of hind foot， I. luminous organ

圖3 三葉蟲螢幼蟲的特殊斑紋Fig.3 Special markings of the larval Emeia pseudosauteri

a. 1齡幼蟲梯形條紋， B. 2齡幼蟲深褐色斑紋， C. 3齡幼蟲花瓣斑紋， D. 5齡幼蟲“八”字形條狀斑紋

a. the trapezoid markings of the first instar larva， B. the brown markings of the second instar larva， C. the petal markings of the third instar larva， D. the “八” glyph markings of the fifth instar larva

2.1.3末齡幼蟲的電鏡掃描三葉蟲螢?zāi)g幼蟲的頭部平時收縮于前胸背板下面，伸出后呈長方形，并長有剛毛(圖4：A)；前胸腹板側(cè)緣有瘤狀突起物，且有剛毛(圖4：B)；幼蟲口器發(fā)達(圖4：C、D)，頭部前端有粗壯的著生剛毛的上顎，為鐮刀狀，1/2處向內(nèi)彎曲，基部有一齒狀突起，末端尖銳，表面有稀疏剛毛(圖4：E)；頭部前端兩側(cè)有可伸縮的觸角，共3節(jié)，第1、2節(jié)長度和粗細相似，表面著生稀疏的長剛毛，第3節(jié)非常小，著生幾根感覺毛，且一側(cè)著生1個很小的圓柱形感受器(圖4：F)。

2.1.4各齡期幼蟲的體長和體寬三葉蟲螢幼蟲從1齡到2齡體長增長緩慢，隨著齡期增大，體長增長較明顯并呈穩(wěn)定上升趨勢，其中，4～6齡幼蟲體長變化相對平緩。1～5齡幼蟲的體寬增長較明顯且增幅穩(wěn)定，6～8齡幼蟲生長較平緩，體寬增長不明顯(圖5)。

2.2 三葉蟲螢的蛻皮

蛻皮前，三葉蟲螢幼蟲保持身體彎曲不動，之后先將頭胸部掙脫出蛻皮，0.5 h左右便會緩慢爬行，尋找一個物體甚至是同類幼蟲輔助掙脫腹部蛻皮的束縛，從而完成蛻皮(圖6)。蛻皮全天均可進行，整個蛻皮過程持續(xù)2～3 h。

蛻皮過程中，幼蟲的體色和硬度會發(fā)生變化(圖7)。剛剛將頭胸部掙脫出蛻皮的幼蟲身體較軟，呈淺粉色；蛻皮成功后，體色逐漸變?yōu)闇\黃色、銀灰色；最后，體色逐漸加深，變?yōu)樵擙g期所應(yīng)保持的體色。體色變化過程持續(xù)1～2 h。

3 結(jié)論與討論

三葉蟲螢幼蟲從低齡到高齡，體色逐漸加深，多邊形紋路逐漸隆起，并于多邊形的中心長出剛毛；外骨骼逐漸變得堅硬，臀足著生的纖毛逐漸變長、變密，增大了與地面的摩擦力，利于爬行時保持身體的平衡，并且顏色逐漸變深；臀足逐漸變得粗大，為中空管狀；體長、體寬逐漸增大，但體長增加更快。

由電鏡掃描圖看出，三葉蟲螢?zāi)g幼蟲的頭部結(jié)構(gòu)與胸窗螢Pyrocoeliapectoralis(秦利鴻，付新華，2009)和端黑螢Luciolapraeusta(梁慧等，2009)非常相似，與云南扁螢Lampyrigerayunnana的頭部結(jié)構(gòu)尤其是口器結(jié)構(gòu)稍有不同(吳健卓等，2016)；頭部甚至腹面的很多部位均長有很多剛毛，顯著提高了幼蟲對環(huán)境的靈敏反應(yīng)；口器屬于捕吸式口器，頭部前端的粗壯鋒利上顎有利于高效捕食，基部的齒狀突起有利于固定獵物(梁慧等，2009)，這些結(jié)構(gòu)提高了三葉蟲螢幼蟲在野外復(fù)雜環(huán)境下的生存能力。

相比而言，三葉蟲螢?zāi)g幼蟲的臀足結(jié)構(gòu)與半水生的穹宇螢Pygoluciolaqingyu很相似，卻與陸生的黃緣窗螢Pyrocoeliaanalis差別較大(劉飄等，2017)。三葉蟲螢是陸生昆蟲，卻喜歡生活在含水量大的濕地等環(huán)境中，這與穹宇螢的環(huán)境相似，所以兩者的臀足結(jié)構(gòu)相似，這再次說明了臀足結(jié)構(gòu)與生活環(huán)境關(guān)系密切。

圖4 三葉蟲螢?zāi)g幼蟲的電鏡掃描
Fig.4 Scanning electron microscope photos of the last-instar of the larvalEmeiapseudosauteri

a.頭部和前胸腹面， B. 前胸腹板側(cè)緣， C. 頭部背面， D. 頭部腹面， E. 上顎， F. 觸角

a. the ventral view of the head and prothorax， B. the lateral margin of prothorax sternum， C. the dorsal head， D. the ventral head， E. mandible， F. antenna

圖5 三葉蟲螢各齡期幼蟲的體長和體寬Fig. 5 Body length and body width of the larval Emeia pseudosauteri of different instars

圖6 三葉蟲螢幼蟲的蛻皮過程Fig.6 Molting of the larval Emeia pseudosauteri

a.頭胸部蛻皮， B. 尋找輔助物， C. 完成蛻皮， D. 完整蛻下的皮殼

a. the molting of the head and thorax， B. looking for the molting auxiliary， C. finishing the molting， D. the integrated slough

圖7 三葉蟲螢幼蟲蛻皮后的體色變化 (黑色箭頭表示變化的順序)Fig.7 The change of body colour of the larval Emeiapseudosauteri after molting (the black arrows indicate the order)

蛻皮時，幼蟲先將頭胸部從舊皮的頭部掙脫出，然后頭胸部向前爬行，依附一定的輔助物將束縛腹部的皮擺脫掉，完成后續(xù)的蛻皮行為。剛蛻皮的幼蟲體色隨時間的推移由淺粉色逐漸加深，變?yōu)榇她g期所應(yīng)有的穩(wěn)定體色。

本文首次對三葉蟲螢各個齡期幼蟲的外部形態(tài)進行了詳細描述，不僅豐富了三葉蟲螢的生物學(xué)研究，還對三葉蟲螢的人工養(yǎng)殖和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有積極意義：可以根據(jù)幼蟲的形態(tài)特征判斷所處的齡期；低齡幼蟲(1～3齡)體色淺，體型小，體表剛毛少，喜高濕度環(huán)境，可以考慮用濕紙巾養(yǎng)殖；隨著幼蟲體型增大，適應(yīng)能力增強，對高濕度的依賴性減弱，同時為了清理方便，可以嘗試用濕海綿養(yǎng)殖；從5齡開始，幼蟲體色變黑，外骨骼變得堅硬，發(fā)光器的亮度較低齡幼蟲明顯變亮甚至達到幼蟲期最亮程度，具有觀賞價值，因此，5齡及其之后齡期的幼蟲具有較大的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值。

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