不同體色虎龍雜交斑的生理特性比較

楊 敏，周夢(mèng)靈，郗宏焱，劉詩(shī)宇，文 鑫

(海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南省水產(chǎn)種業(yè)工程研究中心，海洋生物國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228)

生物的體色是生物長(zhǎng)期進(jìn)化以適應(yīng)環(huán)境的重要手段，對(duì)生物的生存具有重要的意義，魚(yú)的體色是區(qū)別它們的重要表型特征之一。目前已知的石斑魚(yú)種類繁多，豐富的體色差異使其可作為研究魚(yú)體色生態(tài)適應(yīng)性的良好材料?；堧s交斑是以經(jīng)2代群體選育的棕點(diǎn)石斑魚(yú)雌體為母本、鞍帶石斑魚(yú)雄體為父本，雜交獲得的F1代，具有育苗成活率高、生長(zhǎng)速度快等優(yōu)勢(shì)。虎龍雜交斑在養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)了較為豐富的體色類型，具體表現(xiàn)為白化、黃化等體色變化差異。本文以4種體色的虎龍雜交斑為研究對(duì)象，對(duì)其肝臟、前腎、脾臟組織中的丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSHST)活力、甘油三酯(TG)含量進(jìn)行檢測(cè)，比較其中與免疫相關(guān)基因的表達(dá)，以探究它們的生理狀態(tài)。同時(shí)，采用蛋白質(zhì)免疫印記試驗(yàn)分析4種體色虎龍雜交斑肝臟組織中MAPK 的激活水平。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)其下游轉(zhuǎn)錄因子，以揭示MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控不同體色虎龍雜交斑生理狀態(tài)的潛在機(jī)制，初步探討不同體色虎龍雜交斑生理狀態(tài)的差異，為其健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的虎龍雜交斑由海南省三亞市晨海水產(chǎn)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)選擇了相同養(yǎng)殖條件下的4 種不同體色，分別是正常體色(黑色，N)、白色(W)、黃色(Y)和黃黑間色(Sc)，如圖1 所示，每種顏色各9 尾個(gè)體，平均長(zhǎng)度為(32±5)厘米，平均體重為(520.3±20.5)克。用MS-222對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行麻醉后解剖采樣，取肝臟(L)、前腎(P)、脾臟組織(SP)樣品保存于-80℃的條件下，用于后續(xù)的酶活檢測(cè)、蛋白印跡分析、實(shí)時(shí)熒光定量分析等。

圖1 4種體色的虎龍雜交斑

2.酶活檢測(cè)

取4種體色虎龍雜交斑的肝臟、前腎、脾臟組織，準(zhǔn)確稱取樣品重量，按重量(克)∶體積(毫升)＝1∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水作為勻漿介質(zhì)，在冰水浴條件下進(jìn)行機(jī)械勻漿，以2 500 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，取上清液用以蛋白質(zhì)濃度和酶活檢測(cè)。谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)活性、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測(cè)定。

3.蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡實(shí)驗(yàn))

利用全蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)提取4 種體色虎龍雜交斑的肝臟組織總蛋白，與上清液以4∶1 比例混合，100℃變性10 分鐘，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將PVDF 膜與TBST 和5%脫脂牛奶在室溫下孵育2 小時(shí)，阻斷非特異性結(jié)合。PVDF膜在4℃以下一抗孵育過(guò)夜。用TBST 洗膜液洗滌PVDF 膜，并進(jìn)行二抗孵育，然后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)和放射自顯影。使用Amersham 成像儀600 系統(tǒng)(GE 醫(yī)療保健生物科學(xué)公司)對(duì)免疫印跡進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

使用Trizol(Invitronen，15596-025)從4 種體色虎龍雜交斑的肝臟、前腎、脾臟組織中提取總RNA，實(shí)驗(yàn)采用了變性瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)NanoDrop2000 對(duì)RNA 樣品的質(zhì)量進(jìn)行了檢測(cè)。每個(gè)樣本共1 微克RNA 用于RNA 樣本的制備。以其中的mRNA為模板，使用HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，R123-01)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR，rtpcr)獲得cDNA，保存于-80℃條件下，用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。選取與虎龍雜交斑免疫相關(guān)的基因以及MAPK 通路下游轉(zhuǎn)錄因子(C-Myc、c-fos、p53、jun-D、igf、ednrb)，通過(guò)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量，用于反映虎龍雜交斑在分子水平上的生理狀態(tài)差異，檢測(cè)指標(biāo)來(lái)源于先前的研究基礎(chǔ)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)使用2×Q3 SYBR qPCR Master Mix(Universal)(上海吐露港生物科技有限公司)進(jìn)行，以β-actin 作為對(duì)照管家基因，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次，最終反應(yīng)體積為20 微升。用閾值周期值(Ct)法測(cè)定基因的表達(dá)水平，利用β-actin測(cè)定各基因的相對(duì)表達(dá)水平。使用Primer 5.0 設(shè)計(jì)的qRT-PCR引物信息如表1所示。

表1 引物信息

5.統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析和LSD法進(jìn)行分析。顯著性水平設(shè)置為P＜0.05，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

二、結(jié)果與分析

1.酶活性檢測(cè)

(1)甘油三酯(TG)活性。比較不同組間的顯著性變化差異，結(jié)果顯示TG 在黃色組肝臟中的含量高，活性顯著高于其他剩余體色組，其他剩余體色組之間TG 活性沒(méi)有顯著性差異。TG 在4 個(gè)不同體色組前腎中的活性顯示，正常體色和白色體色組顯著高于黃黑間色和黃色組，其中正常體色組和白色體色組之間無(wú)顯著性差異，黃黑間色組和黃色組之間沒(méi)有顯著性差異。在4個(gè)不同體色組脾臟組織中的活性顯示，正常體色組顯著高于其他體色變異組。

(2)丙二醛(MDA)活性。對(duì)于4個(gè)不同體色組的肝臟組織中的活性，比較不同組間的顯著性變化差異，結(jié)果顯示丙二醛(MDA)在黃色組中的含量高，活性顯著高于其他剩余體色組，黃黑間色組顯著低于黃色體色組但顯著高于正常體色和白色體色組，正常體色和白色體色組之間沒(méi)有顯著性差異。MDA 在4 個(gè)不同體色組的前腎中的活性顯示，黃黑間色體色組顯著高于白色體色和黃色體色組。MDA 在4 個(gè)不同體色組的脾臟中的活性顯示，黃色體色組顯著高于其他剩余體色組，正常體色組顯著低于其他變異體色組，MDA活性在白色與黃黑間色體色組之間沒(méi)有顯著性差異。

(3)谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)活性。對(duì)于4個(gè)不同體色組的肝臟組織中的活性，比較不同組間的顯著性變化差異顯示，GSH-ST 在黃色體色組中的活性顯著高于正常體色組、白色體色組、黃黑間色體色組，白色體色組的活性顯著低于其他體色組，其中正常體色和黃黑間色體色組之間GSH-ST 活性沒(méi)有顯著性差異。正常體色組前腎中的GSH-ST 活性顯著高于白色體色組、黃黑間色體色組、黃色體色組，黃黑間色體色組顯著高于黃色體色組。GSH-ST 在正常體色組脾臟中的活性顯著低于其他變異體色組。

2.參與MAPK通路的蛋白質(zhì)表達(dá)水平

通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印記試驗(yàn)，在4個(gè)不同體色組的肝組織中均檢測(cè)到MAPK 通路在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。在變異體色組個(gè)體中檢測(cè)到的p38MAPK 和ERK1/2、磷酸化水平均顯著高于正常體色組。白色體色和黃色體色組的JNK1 的磷酸化水平顯著高于正常體色組，表明該通路的激活水平與體色變化存在一定的聯(lián)系。

3.參與免疫調(diào)控基因的表達(dá)比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)參與免疫調(diào)控的基因在4 個(gè)不同體色組的3 個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，在肝臟組織中，c-fos、jun-D、p53、ednrb 4 種基因在黃色體色組中的表達(dá)量最高；C-Myc、igf 在黃黑間色體色組中的表達(dá)量最高；c-fos、C-Myc、jun-D、p53、ednrb、igf 6 種基因在白色體色組中的表達(dá)量最低。在前腎組織中，c-fos、C-Myc、jun-D、ednrb、igf在黃色體色組中表達(dá)量最高；p53在白色體色組中表達(dá)量顯著升高。在脾臟組織中，c-fos在白色體色組中的表達(dá)量顯著升高，在黃黑間色和黃色體色組中無(wú)顯著性差異；C-Myc在黃色體色組中的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，在白色和黃黑間色體色組中無(wú)顯著性差異。jun-D 在白色體色組中的表達(dá)量無(wú)顯著升高，在黃黑間色和黃色體色組中的表達(dá)量顯著性降低。p53 在黃黑間色體色組中的表達(dá)量稍有降低。ednrb、igf 兩種基因在白色體色組中的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，但在黃黑間色和白色體色組中無(wú)顯著性差異。

綜上，黃色體色組虎龍雜交斑與正常體色組相比，肝臟中的GSH-ST、MDA、TG 含量相對(duì)較高，MAPK 通路的ERK1/2、JNK1 和p38MAPK 激活水平較高，下游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量較高，在免疫組織中檢測(cè)到了顯著上調(diào)的igf、ednrb 基因。黃黑間色體色組和白色體色組與正常體色組相比部分免疫指標(biāo)也呈現(xiàn)出了顯著的變化。因此，4種不同體色虎龍雜交斑的生理狀態(tài)存在一定的差異。這些差異的產(chǎn)生可能是由于不同體色的虎龍雜交斑抗氧化應(yīng)激能力存在差異，在環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，該差異在不同程度上影響了谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)活力、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)含量、MAPK通路激活水平及其下游轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)免疫基因的表達(dá)量，這些免疫指標(biāo)的變化參與到機(jī)體的調(diào)控中，最后表現(xiàn)在生理狀態(tài)的差異上。目前對(duì)于導(dǎo)致不同體色虎龍雜交斑出現(xiàn)不同生理狀態(tài)的機(jī)制還需進(jìn)一步探究。