張建梅,羅艷艷,羅海青,王益君,沈 婷,紀(jì)麗蓮,*,胡衛(wèi)成,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.淮陰師范學(xué)院江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇淮安 223300;3.天津科技大學(xué)造紙學(xué)院,天津 300457)

大蒜是一種百合科蔥屬1～2年生草本植物的地下鱗莖,分布在世界各地,原產(chǎn)自亞洲西部高原,在我國主要分布在云南、山東等省份[1]。大蒜含有人體所需的維生素、氨基酸及微量元素,具有一定的保健和營養(yǎng)功能。黑蒜又名發(fā)酵黑蒜,是白大蒜經(jīng)發(fā)酵發(fā)生酶促褐變和非酶褐變反應(yīng)的產(chǎn)物,反應(yīng)過程中美拉德反應(yīng)最終產(chǎn)物-類黑素使白蒜產(chǎn)生了顏色變化。相比于白蒜,黑蒜的辛辣氣味大大降低,口感酸甜,噻吩、呋喃等含硫化合物含量增加[2]。由于黑蒜含有大量有機(jī)硫化合物,黑蒜比新鮮大蒜具有更強(qiáng)的抗氧化活性[3]。研究表明黑蒜具有許多生物活性,可用作抗癌劑[4]、抗菌藥物[5]、抗糖尿病[6]和抗氧化劑[7-8]。近年來,黑蒜作為健康綠色食品進(jìn)入市場受到越來越多消費(fèi)者的青睞,如何使黑蒜加工之后效果更佳,是現(xiàn)在大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用黑蒜的關(guān)鍵。

超微粉碎技術(shù)是一種新型的物料加工技術(shù),是制備具有良好表面性質(zhì),如分散性和溶解性的超細(xì)粉末的有用工具[9],利用各種粉碎設(shè)備對物料進(jìn)行不斷的擠壓、碰撞等,改變物質(zhì)粒徑,改善其物化性質(zhì)。20世紀(jì)70年代,超微粉碎技術(shù)在食品、生物技術(shù)、醫(yī)藥以及其他行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用。在食品生產(chǎn)中,超微粉碎技術(shù)可以減小纖維顆粒粒徑的范圍至1 nm～100 μm,提高與產(chǎn)品營養(yǎng)和烹飪性能相關(guān)粉末的質(zhì)量[10]。與傳統(tǒng)的粉碎技術(shù)相比,超微粉碎產(chǎn)品的粒徑更小,比表面積增大,比表面活性更大,同時(shí)增加了與水等的接觸面積,更有利于活性物質(zhì)的溶出。超微粉碎技術(shù)不僅改變了物料的物理特性,也改善了物料的生理活性。超微粉碎后的微粒吸附性、溶解性等相應(yīng)增大,且增加了物料的可應(yīng)用性,對芳香性、熱敏性的物料有保鮮的作用,同時(shí)具有一定的滅菌作用,提高產(chǎn)品衛(wèi)生水平等優(yōu)點(diǎn)[11]。目前,超微粉碎技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于玉米秸稈[12]、小麥[13]、姜[11]、蘑菇[14]、稻草[15]、綠茶[16]等不同材料的粉末物理化學(xué)和營養(yǎng)特性的研究,并取得了很好的應(yīng)用效果。但是,迄今為止關(guān)于超微粉碎技術(shù)在黑蒜加工粉碎中的應(yīng)用情況很少。

本文以黑蒜為研究對象,以傳統(tǒng)的機(jī)械粉碎為對照,通過對比超微粉碎和機(jī)械粉碎方式在物理特性及生物活性方面的差異,研究超微粉碎對黑蒜粉末物理性質(zhì)及抗氧化能力的影響,不僅為黑蒜深入的研究與發(fā)展提供理論依據(jù),也為超微粉碎技術(shù)在食品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑蒜 菏澤天鴻果蔬有限公司;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)、熒光素(FL)、二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)、槲皮素(Quercetin)、2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、水溶性維生素E(Trolox) 以上試劑純度均大于98%，Sigma公司;福林試劑、碳酸鈉、氯化鐵、無水乙醇、甲醇 均為分析純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DMEM培養(yǎng)基 Gibco公司;人肝腫瘤細(xì)胞HepG2 美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。

NLD-6A型超微粉碎機(jī) 濟(jì)南納力德超微粉碎技術(shù)有限公司;Mastersizer 2000型激光粒徑儀 英國馬爾文公司;Tecan Infinite M200PRO型酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;FEI Quanta 450FEG型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國FEI公司;Q-250B3型高速多功能粉碎機(jī) 上海冰都電器有限公司;MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱 日本SANYO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 新鮮的黑蒜60 ℃恒溫干燥24 h至恒重,將干燥的黑蒜放高速多功能粉碎機(jī)粉碎,過篩得到黑蒜機(jī)械粉;將經(jīng)粗粉碎的黑蒜加入超微粉碎機(jī)中粉碎,溫度設(shè)為4 ℃,粉碎時(shí)間為10 min,過篩得到粒徑在1～100 μm范圍的黑蒜超微粉。

1.2.2 黑蒜粉粒度測定 取25 mg黑蒜的超微粉和機(jī)械粉溶于10 mL蒸餾水(分散劑)中,室溫?cái)嚢?0 min,混勻后于25 ℃用激光粒徑儀進(jìn)行分析。

1.2.3 黑蒜粉微觀形態(tài)觀察 將黑蒜樣品超微粉碎和機(jī)械粉碎后,分別取樣品適量,鋪于電鏡銅網(wǎng)上后,置于掃描電子顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.4 不同粉碎方式的黑蒜粉末理化性質(zhì)研究

1.2.4.1 休止角 休止角測定參照Ileleji等[17]的方法。準(zhǔn)確稱取不同粉碎方式的黑蒜粉末各5 g,固定好玻璃漏斗,使漏斗尾端距玻璃平板垂直距離3.5 cm,黑蒜粉末通過玻璃漏斗垂直流至玻璃平板上,流下的黑蒜粉末形成圓錐體,分別測定圓錐體的垂直高度H和底面半徑R,水平面和圓錐表面夾角(α)即為黑蒜粉末的休止角,重復(fù)測定3次,休止角的公式如下:

α(°)=arctan H/R

1.2.4.2 松密度 準(zhǔn)確稱取不同粉碎方式的黑蒜粉末各5 g,至50 mL量筒中,測定其體積(V),重復(fù)測定3次,計(jì)算松密度:

P(g/mL)=m/V

1.2.4.3 持水性 持水性(WHC)測定參照Anderson等[18]的方法。取干凈的離心管并稱其質(zhì)量(M1,g),準(zhǔn)確稱取黑蒜樣品5 g(M2,g)溶于100 mL蒸餾水,混合均勻,置于50 ℃水浴鍋中加熱30 min,冷卻至室溫后,4000 r/min離心30 min。離心后將上層液去掉,重新稱質(zhì)量(M3,g),重復(fù)測定3次,持水性公式如下:

1.2.4.4 水溶性 水溶性指數(shù)(WSI)測定參照Zhang 等[19]的方法,準(zhǔn)確稱取不同粒度的黑蒜粉末1 g(S1,g),按1∶20 (g/mL)比例加入去離子水,充分混勻,將混合好的溶液置50 ℃水浴鍋加熱30 min,冷卻至室溫后,4000 r/min 離心30 min。取干凈燒杯并中稱其質(zhì)量(S2,g),將離心后的上層液放入燒杯并在烘箱中干燥,將干燥好的樣品與燒杯稱重(S3,g),重復(fù)測定3次,水溶性指數(shù)公式如下:

1.2.4.5 溶脹度溶脹度(SWC)測定 參照Lecumberri等[20]的方法。準(zhǔn)確稱取黑蒜粉末1 g(M)慢慢倒入量筒中,記體積V1,按1∶ 20 (g/mL)比例加入去離子水,充分混勻,將混勻的溶液在室溫下放置24 h,使粉末盡可能膨脹,記錄濕粉的體積V2,重復(fù)測定3次,溶脹度公式如下:

1.2.4.6 黑蒜持油力(OHC)測定 參照Sangark等[21]的方法,準(zhǔn)確稱取不同粒徑的黑蒜樣品1 g(W1)于100 mL燒杯中,加入20 mL植物油,攪拌充分溶解,置于離心機(jī)中4000 r/min離心30 min,移去上清液,稱量沉淀重量為W2,重復(fù)測定3次,持油力公式如下:

1.2.5 黑蒜乙醇提取液的制備 分別稱取1 g黑蒜樣品機(jī)械粉和超微粉,按1∶20的料液比加入50%的乙醇溶液20 mL,30 ℃條件下超聲提取30 min,離心10 min(6000 r/min),過濾后用50%的乙醇定容至20 mL作為樣品液待用。

1.2.6 黑蒜提取液中多酚含量的測定

1.2.6.1 標(biāo)曲制備 取0.02 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,用80%乙醇溶解并定容至 50 mL。準(zhǔn)確量取0.2 mL不同濃度(0、12.5、25、50、100、150、200、250、300、350、400 μL)的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于離心管中,依次加入1 mL蒸餾水,0.2 mL福林試劑,充分搖勻,室溫靜置3 min后加入0.6 mL 7.5%碳酸鈉,室溫靜置40 min,在波長765 nm處測定其吸光度,并以Y軸為吸光度;X軸為多酚質(zhì)量濃度(μg/mL),繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0053X+0.0385,R2=0.9968。

1.2.6.2 樣品測定 分別吸取1 mL超微粉碎和機(jī)械粉碎黑蒜乙醇提取液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法,于波長765 nm處測定吸光度。樣品總多酚含量以每100 g樣品中所含沒食子酸的毫克數(shù)表示(mg/GA eq/100 g)。

1.2.7 體外抗氧化能力的測定

1.2.7.1 清除DPPH自由基的測定 向96孔透明板中分別加入100 μL不同濃度的黑蒜提取液(0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL),再加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液。依照相同的操作方法,將不同濃度的樣品液分別與甲醇混勻作為空白組,DPPH溶液與甲醇混勻作為對照組。避光室溫靜置30 min后,在波長517 nm處測其吸光值,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),每次3組平行,取平均值。

式中:A1:DPPH溶液與待測液的吸光度之和;A2:待測液與溶劑的吸光度之和;A3:DPPH溶液與溶劑的吸光度之和。

1.2.7.2 Fe3+還原能力的測定 取0.2 mL不同濃度的黑蒜提取液(0.1、1、2、4、8、10 mg/mL),加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)和0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,于50 ℃水浴20 min,加入0.5 mL 10%的三氯乙酸溶液,混合后離心3 min(2000 r/min),取上清液0.5 mL,加入0.5 mL蒸餾水和0.1 mL三氯化鐵溶液(0.1%),混勻后靜置10 min。在波長700 nm處測定吸光度,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),每次3組平行,取平均值。

1.2.7.3 清除ABTS+自由基的測定 將ATBS用磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH7.2)溶解配制成7 mmol/L溶液,與2.45 mmol/L過硫酸鉀等體積混勻,室溫避光反應(yīng)12～16 h,制備成ABTS+儲(chǔ)備液。取20 μL不同濃度黑蒜提取液(0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL)加到96孔透明酶標(biāo)板中,分別加入150 μL ABTS+儲(chǔ)備液,室溫反應(yīng)10 min后,在波長517 nm處測其吸光值,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),每次3組平行,取平均值。

式中:A0:ABTS+工作液與PBS的吸光度之和;A:ABTS+工作液與樣品液的吸光度之和。

1.2.7.4 氧自由基吸收能力(ORAC)的測定 分別吸取20 μL不同粉碎方式處理的黑蒜提取液于96孔酶酶標(biāo)板中,加入180 mL FL于37 ℃條件下孵育20 min后,隨后加入20 μL ABAP溶液(119 mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng),以激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長535 nm測定熒光強(qiáng)度,測定時(shí)間間隔為5 min,連續(xù)測定35次。ORAC值以Trolox當(dāng)量表達(dá),單位為μmol TE/g DW。

1.2.8 細(xì)胞抗氧化能力(CAA)的測定

1.2.8.1 細(xì)胞培養(yǎng)人肝腫瘤細(xì)胞 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含終濃度為10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)及鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),設(shè)置培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)進(jìn)行傳代,待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后,進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.8.2 細(xì)胞抗氧化(CAA)活性實(shí)驗(yàn) 參照Bender C等[22]的方法將HepG2細(xì)胞以每孔6×104個(gè)接種于96孔板中,每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基,待培養(yǎng)24 h后,移去培養(yǎng)基,用PBS清洗每個(gè)接種孔后,加入100 μL用25 μmol/L DCFH-DA稀釋成不同濃度的樣品,培養(yǎng)1 h后,用100 μL PBS清洗每個(gè)孔,移去PBS,加入600 μmol/L、100 μL ABAP工作液,以100 μL氧化劑處理的培養(yǎng)基為對照。以激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長535 nm測定熒光強(qiáng)度,測定60 min,每5 min測定一次。測定時(shí)間間隔為5 min,持續(xù)1 h。CAA值為每100 g干物質(zhì)(DM)相當(dāng)于槲皮素的量,單位為μmol QE/100 g DM。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,各組間兩兩比較采用SNK-q驗(yàn)證,以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粉碎方式的黑蒜粒度測定結(jié)果

圖1為黑蒜超微粉碎的粒徑分布圖,黑蒜的粒徑在1～100 μm之間,中位粒徑D50為17.71 μm;而機(jī)械粉碎的黑蒜粉末因?yàn)榱教?無法用機(jī)械檢測;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)超微粉碎處理后,黑蒜粉末的粒徑明顯減小且范圍相對集中,有利于提高其溶解度和分散性。

圖1 黑蒜超微粉粒徑分布圖

2.2 不同粉碎方式的黑蒜微觀形態(tài)觀察

由圖2a可知,黑蒜機(jī)械粉組織碎塊殘留較大,細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損較小,整體相對完整且表面光滑;由圖2b可知,超微黑蒜細(xì)胞破損嚴(yán)重,表面粗糙,大顆粒形貌復(fù)雜,大多呈不規(guī)則狀態(tài),幾乎看不到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織碎片。

圖2 機(jī)械粉碎與超微粉碎粒黑蒜心電鏡掃描圖(2000×)

2.3 不同粉碎方式的黑蒜物理特性研究

休止角是表示粉體流動(dòng)性能的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為,休止角越小,表示粉體的流動(dòng)性越好,反之,則越差。由表1可以看出,超微粉碎黑蒜粉的休止角顯著高于機(jī)械粉碎,這與代紅飛等[23]的研究結(jié)果相反。這可能是因?yàn)槲⒘Ａ皆叫?比表面積越大,表面能升高,粉末處于非穩(wěn)定狀態(tài),更易吸附和凝聚,引起流動(dòng)性變差。松密度的大小隨著粒徑變小而增大,這說明黑蒜粉末粒度越小,流動(dòng)性變差,且對粉體的填充有不利影響,且隨著粒度減小,比表面積增大,表面電荷增加,粉體的黏度和吸附性也得到增強(qiáng)[24-26]。

表1 不同粉碎方式的黑蒜物理特性

與機(jī)械粉碎相比,超微粉碎的黑蒜粉末持水力和溶脹度分別提高了30.38%和39.53%,二者差異達(dá)差異顯著水平,說明超微粉碎對黑蒜粉末的持水力和溶脹度具有一定的改善作用。這一方面可能是超微粉碎后,黑蒜粉末粒度變小,比表面積增大,增加了顆粒與水的接觸面積,且黑蒜中親水集團(tuán)暴露率增大,增加黑蒜粉末的水結(jié)合能力[27],另一方面可能因?yàn)槲锪祥g的孔隙增多使水分更易滲入,從而增大其持水率和溶脹度。超微粉碎的黑蒜粉的水溶性指數(shù)顯著高于機(jī)械粉碎的黑蒜粉,這是因?yàn)槌⒎鄣牧綔p小,比表面積增加,水分與微粒充分接觸,增加了黑蒜的溶出率。超微粉碎的黑蒜粉持油力的增加其原因可能是隨著黑蒜粒徑的減小,比表面積增大,使其可以吸附更多的油脂。由此可見,超微粉碎能明顯改善黑蒜的水溶性、持油力、持水力等物理性質(zhì)。與機(jī)械粉碎相比，超微粉碎后的黑蒜粉末水溶性、溶脹度及多酚類物質(zhì)的溶出率分別增加了26.84%、39.53%和31.76%，由此可見，超微粉碎能明顯改善黑蒜的水溶性、持油力、持水力等物理性質(zhì)，為黑蒜的深加工提供理論依據(jù)。

2.4 不同粉碎方式的黑蒜多酚含量的測定

黑蒜抗氧化活性的主要成分是多酚類物質(zhì),多酚類物質(zhì)的提取率不僅受到溶劑種類、溶劑用量、提取溫度等條件的影響,也受到物料的粉碎粒度的影響。超微粉碎可使物質(zhì)的粒徑達(dá)到幾十微米,有利于物質(zhì)內(nèi)多酚等活性成分的溶出。由圖3可知,超微粉碎黑蒜提取液的多酚含量為3.81 mg/GA eq/g DW,而機(jī)械粉碎黑蒜提取液多酚含量為2.60 mg/GA eq/g DW,超微粉碎的黑蒜多酚含量顯著多于機(jī)械粉碎。由此可以說明超微粉碎能促使細(xì)胞的破碎,更加有助于黑蒜多酚的溶出。李鳳英等[28]研究發(fā)現(xiàn)超微粉碎玫瑰花多酚的溶出量與粒徑的大小有關(guān)。說明由于提取方法、粒徑大小不同等因素導(dǎo)致黑蒜多酚溶出量的提高,另外,由于黑蒜本身的發(fā)酵方式與提取條件的不同也可造成多酚含量的差異,但總的來看,相較于機(jī)械粉碎,超微粉碎的活性成分溶出率更高。

圖3 不同粉碎方式的黑蒜多酚含量

2.5 不同粉碎方式的黑蒜提取液對DPPH·的清除效果

由圖4可知,超微粉碎和機(jī)械粉碎黑蒜提取液對DPPH·都有很強(qiáng)的清除能力,隨處理濃度的增加,二者對DPPH·清除能力都顯著增強(qiáng),且與處理濃度呈正相關(guān);相同濃度下超微粉碎黑蒜的清除能力明顯高于機(jī)械粉碎。超微粉碎和機(jī)械粉碎半抑制濃度 IC50分別為1.78 mg/mL 和2.94 mg/mL,IC50濃度越低,表明自由基清除能力越強(qiáng)。由于黑蒜粉末粒徑減小,導(dǎo)致抗氧化活性物質(zhì)的溶出率增加,DPPH·清除能力增強(qiáng)。張小利等[29]研究超微粉碎對香菇多酚DPPH自由基清除能力影響時(shí),發(fā)現(xiàn)超微粉碎后香菇中單酚含量升高,DPPH·清除力增強(qiáng)。由此說明超微粉碎處理能增加黑蒜粉提取液的DPPH·清除能力,提高其抗氧化活性。但隨著濃度增高達(dá)到8 mg/mL時(shí),超微粉碎黑蒜提取液的自由基清除能力增加緩慢,且與機(jī)械粉碎的差距變小,這可能是由于提取液濃度增加到一定程度時(shí),黑蒜粉提取液中的抗氧化成分自氧化,削弱了超微粉碎黑蒜提取液清除DPPH·的能力。

圖4 不同粉碎方式的黑蒜提取液濃度對DPPH·的清除能力

2.6 不同粉碎方式的黑蒜提取液還原力的測定

衡量樣品的抗氧化活性的標(biāo)準(zhǔn)有很多,而其中還原力的強(qiáng)弱是評價(jià)抗氧化劑活性的常用方法,樣品作為一種還原劑,其還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)。多酚作為一種天然抗氧化劑,具有很強(qiáng)的抗氧化性,而黑蒜中的多酚溶出率增加,則其還原力增強(qiáng),進(jìn)而可以通過測定樣品的還原能力,來評價(jià)黑蒜樣品的抗氧化能力,因此,可通過測定不同粉碎方式的黑蒜的還原力,來評價(jià)超微粉碎對黑蒜抗氧化能力的影響。由圖5可以看出,隨著黑蒜提取液濃度的升高,兩種粉碎方式黑蒜的還原能力都逐漸升高。在2 mg/mL時(shí),超微粉碎和機(jī)械粉碎黑蒜的還原能力差異不顯著(p>0.05),當(dāng)濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí),超微粉碎黑蒜還原力為機(jī)械粉碎的1.31倍,當(dāng)濃度達(dá)到8 mg/mL時(shí),超微粉碎黑蒜還原力為機(jī)械粉碎的1.42倍,Zhu等[30]研究發(fā)現(xiàn)樣品所含的多酚類物質(zhì)的多少與樣品中還原能力強(qiáng)弱呈正相關(guān)性,本研究中,超微黑蒜總酚的含量達(dá)到3.81 mg/GA eq/g DW,而機(jī)械粉碎黑蒜為2.60 mg/GA eq/g DW,說明超微粉碎能顯著提高黑蒜粉末的還原力。

圖5 不同粉碎方式的黑蒜提取液還原力

2.7 不同粉碎方式的黑蒜提取液對ABTS+·自由基的清除

由圖6可以看出,隨黑蒜提取液濃度的增加,黑蒜提取液對ABTS+·清除能力大致呈遞增趨勢,相同濃度下超微粉碎的ABTS+·清除率明顯高于機(jī)械粉碎,不同濃度下二者的的清除能力達(dá)差異顯著水平。當(dāng)提取液濃度為0.1 mg/mL時(shí),清除能力有減弱趨勢;當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí),超微粉碎黑蒜提取液的清除率達(dá)到38.71%,而機(jī)械粉碎的清除率只有20.35%;當(dāng)達(dá)到1 mg/mL時(shí),差距為14.43%。存在差異的原因可能是黑蒜提取液濃度的增大,超微和機(jī)械粉碎黑蒜中的活性成分含量增高。蔡亭等[31]研究發(fā)現(xiàn),超微粉碎能夠增加苦蕎微粉中游離態(tài)、結(jié)合態(tài)及總多酚類植物活性物質(zhì)對ABTS+·清除能力,由此推測超微粉碎黑蒜提取液的ABTS+·清除能力顯著高于機(jī)械粉碎,可能會(huì)與多酚類物質(zhì)的形態(tài)有關(guān)。但不能否認(rèn)的是,除多酚類物質(zhì)外,超微粉黑蒜提取液中還有黃酮類及生物堿等其他活性物質(zhì)對ABTS+·也具有一定的清除能力,增強(qiáng)其抗氧化活性。

圖6 不同粉碎方式的黑蒜對ABTS+·自由基的清除能力

2.8 不同粉碎方式的黑蒜提取液對氧自由基的清除能力

由圖7可以看出,超微粉碎黑蒜和機(jī)械粉碎黑蒜均具有很強(qiáng)的氧自由基清除能力,但超微粉碎黑蒜的氧自由基吸收能力為1134.42 μmol TE/g DW,機(jī)械粉碎的黑蒜樣品氧自由基吸收能力僅為984.56 μmol TE/g DW,說明經(jīng)超微粉碎的黑蒜粉對氧自由基的清除能力顯著增強(qiáng)。這可能是由于超微粉碎處理后,黑蒜粉粒徑減小,黑蒜超微粉提取液中的多酚等抗氧化成分與提取溶劑接觸表面積增大,提取率增加;另一方面,超微粉碎使得黑蒜粉中細(xì)胞壁破損嚴(yán)重,細(xì)胞中的抗氧化成分溶出率增加,對氧自由基的清除能力相應(yīng)增加,這與胡立玉[32]研究超微粉碎對南瓜營養(yǎng)成分抗氧化能力的結(jié)果一致。由此可見,超微粉碎能夠促進(jìn)黑蒜超微粉中抗氧化成分的溶出,增加對氧自由基的清除能力,進(jìn)一步提高黑蒜超微粉的抗氧化能力。

圖7 不同粉碎方式的黑蒜對氧自由基的清除

2.9 不同粉碎方式的黑蒜提取液的細(xì)胞抗氧化能力

體外化學(xué)抗氧化評價(jià)方法是在非生理性的環(huán)境條件下進(jìn)行的,未考慮抗氧化劑在體內(nèi)的作用效果,不能全面地評價(jià)受試物的抗氧化活性。受試物在細(xì)胞水平的抗氧化評價(jià)彌補(bǔ)了在化學(xué)評價(jià)體系中的不足。細(xì)胞抗氧化法測定黑蒜對細(xì)胞抗氧化能力比化學(xué)法更具有生理性,其采用HepG2細(xì)胞為研究對象,結(jié)果用斛皮素當(dāng)量(Quercetin Eqivalents)表示。圖8所示,機(jī)械粉碎黑蒜的細(xì)胞抗氧化能力為348.54 μmol QE/100 g DW,超微粉碎黑蒜的細(xì)胞抗氧化能力為456.74 μmol QE/100 g DW,說明,相較于機(jī)械粉碎,超微粉碎黑蒜粉末具有更高的細(xì)胞抗氧化能力,這可能是因?yàn)槌⒎鬯榈姆绞接欣诤谒饧?xì)胞壁及細(xì)胞膜的破碎,更有利于抗氧化活性物質(zhì)的溶出。細(xì)胞內(nèi)的活性氧ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF,這些活性物質(zhì)可與細(xì)胞內(nèi)的活性氧結(jié)合,防止DCFH氧化生成DCF,從而抑制細(xì)胞的氧化。李瑤等[33]建立HepG2細(xì)胞模型研究香菇柄粉多酚抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)未經(jīng)PBS清洗處理的香菇柄粉游離酚的細(xì)胞抗氧化活性值為9.90～24.22 μmol QE/100 g DW,細(xì)胞抗氧化活性值隨粉體粒徑減小而降低,經(jīng)PBS清洗處理后,氣流超微粉碎的抗氧化活性為0.65 μmol QE/100 g DW,普通粉碎組和納米超微粉碎組未表現(xiàn)出細(xì)胞抗氧化活性,得出結(jié)論超微粉碎能在一定程度上增強(qiáng)香菇柄粉的細(xì)胞抗氧化活性。由此推測黑蒜粉提取液中的細(xì)胞抗氧化活性成分可能是多酚以外的其他物質(zhì),且細(xì)胞抗氧化活性還與細(xì)胞的處理方式和超微粉碎方式有關(guān)。

圖8 不同粉碎方式的黑蒜細(xì)胞抗氧化能力

3 結(jié)論

以黑蒜為研究對象,研究不同粉碎方式對黑蒜的物理特性及其抗氧化活性的影響。結(jié)果表明,黑蒜經(jīng)超微粉碎處理后,粒徑減小且粒徑范圍相對集中,改善了黑蒜樣品的持水力、水溶性、溶脹度等理化性質(zhì),提高了活性物質(zhì)的溶出率。通過化學(xué)方法測定不同粉碎方式黑蒜提取液的抗氧化能力,研究表明超微粉碎后的黑蒜多酚比機(jī)械粉碎的黑蒜多酚溶出率高出31.76%,超微粉碎黒蒜提取液的還原能力、DPPH·、ABTS+·及氧自由基清除能力增強(qiáng),并表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。為了更全面的評價(jià)不同粉碎方式的黑蒜抗氧化能力,以人肝癌HepG2細(xì)胞建立細(xì)胞模型,研究黑蒜的細(xì)胞抗氧化能力,超微粉碎黑蒜的細(xì)胞抗氧化能力為456.74 μmol QE/100 g DW,而機(jī)械粉碎黑蒜的細(xì)胞抗氧化能力僅為348.54 μmol QE/100 g DW,表明超微粉碎的黑蒜細(xì)胞抗氧化能力比機(jī)械粉碎的黑蒜細(xì)胞抗氧化能力更強(qiáng)。由此可見,物質(zhì)粒徑的大小,會(huì)對其活性能力產(chǎn)生影響,表明超微粉碎的黑蒜粉比機(jī)械粉碎的黑蒜粉有著更強(qiáng)的抗氧化能力。本研究為深入研究超微技術(shù)提供了理論依據(jù),同時(shí),對進(jìn)一步研究黑蒜的抗氧化能力具有指導(dǎo)意義,也為合理的開發(fā)利用黑蒜粉加工新產(chǎn)品提供了科學(xué)依據(jù)。

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