張前燕 朱濱 馮家銀 黃年平

一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP)是指一氧化碳中毒患者經(jīng)搶救在急性中毒癥狀恢復(fù)后數(shù)天或數(shù)周表現(xiàn)正?；蚪咏５摹凹儆凇焙笤俅纬霈F(xiàn)以急性癡呆為主的一組神經(jīng)精神癥狀[1]。目前對(duì)DEACMP的發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究結(jié)果顯示，DEACMP的發(fā)生與免疫功能紊亂有關(guān)[2]。Jun氨基末端激酶(jun amino-terminal kinase，JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路的重要成員，是細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵通路。研究顯示，JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與多種腦組織疾病的發(fā)病過(guò)程相關(guān)[3]。S100β蛋白是腦組織中與腦功能和神經(jīng)系統(tǒng)功能維系的關(guān)鍵蛋白，可作為腦損傷后的神經(jīng)生化標(biāo)識(shí)物[4]。本研究探討了DEACMP患者腦脊液中S100β、JNK通路蛋白、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)及干擾素γ(IFN-γ)水平的變化及其臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象收集2010-1—2016-12作者醫(yī)院收治的DEACMP患者20例(DEACMP組)，其中男12例、女8例，年齡24～68歲，平均(39.9±9.8)歲，病程19～72 d，平均(38.6±14.0)d，平均假愈期(25.6±9.3)d，受教育年限5～16年，平均(11.3±3.2)年。另收集同期發(fā)生一氧化碳中毒但未發(fā)生遲發(fā)性腦病的患者37例作為對(duì)照組，其中男21例、女16例，年齡22～69歲，平均(37.5±11.3)歲，病程3～18 d，平均(5.2±2.0)d，受教育年限6～16年，平均(11.0±3.5)年。兩組患者年齡、性別、受教育年限比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～69歲；(2)DEACMP診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《職業(yè)性急性一氧化碳中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》(GBZ23-2002)；(3)具有明確的一氧化碳中毒病史，中毒時(shí)具有昏迷史；(4)DEACMP患者入院后經(jīng)CT、MRI檢查可發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性損傷病灶，腦電圖檢查異常；(5)資料完整；(6)患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往具有精神疾病、認(rèn)知功能障礙、癡呆等疾??；(2)既往具有腦血管病史；(3)伴有顱內(nèi)占位性病變或顱腦創(chuàng)傷病史。

1.2方法

1.2.1血標(biāo)本采集：于入院后第2天采集空腹靜脈血5 mL，經(jīng)離心取上清液，置于-20℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.2S100β蛋白測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)S100β蛋白含量，試劑盒購(gòu)自研域(上海)化學(xué)試劑有限公司，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用Statfax 4200美國(guó)酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2.3JNK通路蛋白檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)，JNK通路蛋白JNK1和JNK2蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Hyclone公司，TNF-ɑ蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，所有操作過(guò)程均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4IL-4、IL-10、TGF-β1及IFN-γ檢測(cè)：采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自上海喬羽生物有限公司，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(MMSE)評(píng)分：于治療2周后進(jìn)行MMSE量表評(píng)價(jià)。MMSE評(píng)分主要包括定向力(10分)、注意力和計(jì)算力(5分)、記憶力(3分)、回憶能力(3分)、語(yǔ)言能力(9分)，總分為30分，MMSE得分≥27分為正常。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組腦脊液相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子比較DEACMP組腦脊液S100β、JNK1、JNK2、TNF-ɑ、IFN-γ水平均高于對(duì)照組(P<0.01)，而IL-4、IL-10、TGF-β1水平均低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2兩組患者M(jìn)MSE評(píng)分比較DEACMP組MMSE評(píng)分低于對(duì)照組〔(18.64±3.15)分比(25.00±2.09)分；t=9.139，P<0.01〕。

2.3腦脊液相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子與MMSE評(píng)分的相關(guān)性DEACMP組患者M(jìn)MSE評(píng)分與腦脊液S100β、JNK1、JNK2、TNF-ɑ、IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與腦脊液IL-4、IL-10、TGF-β1水平呈正相關(guān)(P<0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 兩組患者腦脊液相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子比較(±s)

注：DEACMP：一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病，JNK：Jun氨基末端激酶，TNF-ɑ：腫瘤壞死因子ɑ，IL-4：白細(xì)胞介素4，TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，IFN-γ：γ干擾素；表2同。a檢測(cè)結(jié)果以與β-actin比值表示

表2 DEACMP患者M(jìn)MSE評(píng)分與腦脊液指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：MMSE：簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表

3 討論

DEACMP 是以癡呆、精神和錐體外系癥狀為主的腦功能障礙[5]。目前關(guān)于其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。因此，探索其發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制對(duì)臨床診斷和早期治療具有重要價(jià)值。

S100β蛋白是一種酸性鈣結(jié)合蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞液中。研究顯示，生理濃度的S100β蛋白具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，高濃度的S100β蛋白具有神經(jīng)毒性，S100β蛋白的過(guò)表達(dá)將提高大腦對(duì)缺血缺氧的易感性，導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡[6-7]。正常狀態(tài)時(shí)，腦脊液及血漿中S100β蛋白含量極低，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，S100β蛋白溢出血-腦脊液屏障進(jìn)入血液循環(huán)，引起外周血其含量升高。因此，腦脊液以及血清S100β蛋白濃度變化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷密切相關(guān)。急性一氧化碳中毒主要引起全身細(xì)胞的缺氧性損害，其中以對(duì)大腦的損害最早。有研究認(rèn)為，S100β蛋白可以作為評(píng)估一氧化碳中毒后腦損傷程度的判斷指標(biāo)[8]。Brvar等[9]通過(guò)對(duì)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，S100β蛋白與一氧化碳中毒預(yù)后密切相關(guān)。Liu等[10]研究顯示，血清S100β蛋白水平增高是急性一氧化碳中毒患者出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Phelps-Polirer等[11]研究發(fā)現(xiàn)，血清s100β蛋白濃度升高是一氧化碳中毒患者早期腦損傷的重要標(biāo)記。JNK信號(hào)通路是細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵通路，與多種腦疾病的發(fā)病相關(guān)，可能是藥物治療的靶點(diǎn)，是目前研究的熱點(diǎn)。研究結(jié)果顯示，JNK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡在帕金森病、缺血缺氧性腦病中起著重要的作用[12]。但目前關(guān)于JNK信號(hào)通路與遲發(fā)型腦病的相關(guān)性報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，DEACMP患者腦脊液中S100β、JNK1、JNK2、TNF-ɑ水平均顯著高于對(duì)照組，其MMSE評(píng)分與腦脊液中S100β、JNK1、JNK2、TNF-ɑ水平呈負(fù)相關(guān)，表明腦脊液中S100β、JNK通路蛋白與DEACMP的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)，提示血清S100β蛋白、JNK1、JNK2、TNF-ɑ水平可作為判斷一氧化碳中毒腦損害程度的客觀指標(biāo)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在DEACMP患者的腦損傷過(guò)程中，免疫反應(yīng)也起了重要作用[13-14]。IL-4作為特征性細(xì)胞因子，具有抑制細(xì)胞免疫，促進(jìn)體液免疫，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞殺傷的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，DEACMP患者IL-4水平低于對(duì)照組，提示IL-4具有保護(hù)作用，表明神經(jīng)免疫損傷機(jī)制有可能參與了DEACMP的發(fā)生。TGF-β1、IL-10是體內(nèi)主要的抑制性細(xì)胞因子，TGF-β1在機(jī)體免疫系統(tǒng)中的作用以負(fù)性調(diào)節(jié)為主，即主要起抑制免疫功能的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，DEACMP組患者腦脊液中TGF-β1水平顯著低于對(duì)照組，而IFN-γ顯著高于對(duì)照組，提示TGF-β1參與抑制DEACMP患者免疫反應(yīng)的作用減弱，導(dǎo)致IFN-γ水平上升，從而可能引起遲發(fā)性腦病的發(fā)生[15]。IL-10可以下調(diào)促炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，可以抑制炎性反應(yīng)、巨噬細(xì)胞的殺傷活性。本研究發(fā)現(xiàn)，DEACMP組患者腦脊液中IL-10水平低于對(duì)照組，表明DEACMP的發(fā)生與神經(jīng)免疫損傷機(jī)制有關(guān)，IL-10、TGF-β1可能協(xié)同進(jìn)行免疫抑制。

綜上所述，DEACMP患者腦脊液中S100β、JNK 通路蛋白及相關(guān)細(xì)胞因子水平發(fā)生明顯改變，且與患者恢復(fù)期認(rèn)知功能損害有關(guān)，提示腦脊液中S100β、JNK通路蛋白與DEACMP的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)。

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