謝璟璐 連志云 劉舉 陳虹西 張勤 石紫燕 姚紹莉 周紅雨

視神經脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一種累及中樞神經系統(tǒng)的炎性脫髓鞘疾病，其主要臨床特征表現為視神經炎和長節(jié)段橫貫性脊髓炎。國際上將視神經脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)定義為包含典型的NMO、視神經炎、急性脊髓炎、大腦綜合征及其組合在內的整個譜系疾病[1]。隨著水通道蛋白4(AQP4)的發(fā)現，又將NMOSD分為血清AQP4-IgG陽性的NMOSD和血清AQP4-IgG陰性的NMOSD(或未知的)[2]。目前研究普遍認為NMOSD的發(fā)病機制與AQP4-IgG介導的自身免疫反應有明顯的相關性[3-4]，但其確切病因和發(fā)病機制仍不完全清楚。既往研究發(fā)現遺傳和環(huán)境因素均與NMOSD的發(fā)病有關[5-7]。Lill等一項研究表明，趨化因子受體5(CXCR5)基因或其臨位的常見基因變異與MS發(fā)病相關[8]。作者假設CXCR5的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)也可能與NMOSD的發(fā)病機制有關，目前尚未檢索到有相關研究證實該假設。因此，本研究對CXCR5基因SNPs與NMOSD的關系進行了探討。

1 對象和方法

1.1對象收集2014-09—2017-04作者醫(yī)院就診的NMOSD患者312例，其中女271例，男41例，平均年齡(41.97±12.25)歲。診斷均符合2015年美國神經病學會發(fā)表的NMOSD診斷標準。另收集同期的健康對照人群(HCs)487例，其中女407例，男80例，平均(40.67±11.56)歲。兩組間年齡、性別構成相匹配(P>0.05)。本研究經四川大學華西醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者及家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集：收集受試者性別、年齡、發(fā)病年齡、病程、年復發(fā)率、擴大殘疾狀態(tài)評分(EDSS)量表、AQP4-IgG、臨床表型和初始癥狀等資料。

1.2.2SNP的選擇和單倍型分析：中國漢族人群CXCR5基因SNPs位點的選擇來源于1000基因組計劃(1KGP)數據庫。標簽SNPs由Haploview軟件4.2版本根據以下條件進行選擇：次要等位基因頻率(MAF)>0.05，哈迪-溫伯格平衡(HWE)P值>0.05，連鎖不平衡(LD)r2>0.8。最終選擇9個標簽SNPs，分別為：rs11574667、rs523604、rs118182497、rs1623316、rs78146216、rs497916、rs598207、rs676925、rs581063(包含上游2 k和下游1 k)。另外1個SNPs rs10892301來源于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的研究[9]。因此該研究包含了10個CXCR5基因的SNPs位點(表1)。

1.2.3SNP檢測：采用乙二胺四乙酸管采集所有受試者外周靜脈血標本3～5 mL?；蚪MDNA由AxyPrep血基因組DNA中量制備試劑盒25-prep(AxyGen，中國)提取，置-20℃儲存待測。9個標簽SNPs由基于雙連鎖和多重熒光聚合酶鏈反應技術的SNP基因分型專利技術自主研發(fā)的48位SNPscan試劑盒(Cat#：G0104，上海天昊生物科技有限公司)進行基因分型，而另一個SNPs(rs10892301)由改進的多重連接酶檢測應答技術(天昊生物科技有限公司)進行基因分型。隨后，從總的DNA樣本中隨機抽取出5%(n=35)用Big Dye-terminator 3.1版本和ABI3730XL自動測序儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)再次測試以確認結果，所得結果一致。

表1 CXCR5基因SNPs位點

注：CXCR5：趨化因子受體5，SNPs：單核苷酸多態(tài)性；表2～3、圖1同。PHWE值：哈迪-溫伯格平衡檢驗P值；MAF：次要等位基因頻率；HCB：中國北京漢族人群

1.3統(tǒng)計學處理使用PLINK v1.07和SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組性別差異和哈迪-溫伯格平衡采用卡方檢驗；計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗；計數資料采用卡方檢驗；采用校正年齡和性別的Logistic回歸分析法對加性、顯性和隱性模型進行分析，計算優(yōu)勢比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)來評估NMOSD的發(fā)病風險。通過Haploview軟件4.2版本進行連鎖不平衡和單倍型分析。P值由功耗和樣本量計算軟件3.1.2版本(Power and Sample Size Calculation)計算，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1NMOSD患者臨床特征NMOSD患者發(fā)病平均年齡(37.48±13.27)歲，病程中位數4.42年，四分位數間距5.76年，擴展殘疾狀態(tài)量表(EDSS)評分(2.7±2.3)分。年復發(fā)率(0.64±0.56)次。AQP4-IgG陽性238例(81.2%，共293例患者進行了抗體檢查)。臨床表型：僅表現為橫貫性脊髓炎97例(31.1%)，僅表現為視神經炎22例(7.1%)，橫貫性脊髓炎+視神經炎188例(60.2%)，其他5例(1.6%)。發(fā)病初始癥狀：視神經炎87例(27.9%)，橫貫性脊髓炎160例(51.3%)，橫貫性脊髓炎+視神經炎34例(10.9%)，腦干綜合征17例(5.4%)，極后區(qū)綜合征12例(3.8%)，癥狀性腦綜合征2例(0.7%)。

2.2等位基因與基因型比較NMOSD患者與健康對照組CXCR5基因SNPs位點的等位基因與基因型頻率見表2。等位基因關聯(lián)分析顯示rs11574667的次等位基因C與NMOSD易感性相關(OR=1.33，95%CI：1.01～1.75，P=0.03)，但加性、顯性及隱性模型中10個SNPs均與NMOSD易感性無關(P>0.05)。

2.3連鎖不平衡與單倍型分析連鎖不平衡結果見圖1。其中確定了2個連鎖不平衡模塊，分別為rs1574667-rs523604-rs118182497(模塊1)與rs598207-rs676925(模塊2)。在模塊1中確定了C-G-A、C-G-G、T-A-G和T-G-G 4個單倍型(頻率>5%)，模塊2中確定了C-C、C-G和G-C 3個單倍型(頻率>5%)。結果顯示模塊1中單倍型C-G-G與NMOSD易感性相關(OR=1.50，95%CI：1.00～2.23，P=0.046)，模塊2中3個單倍型均未顯示出與NMOSD發(fā)病相關(P>0.05)。結果見表3。

3 討論

NMO曾一度被認為是多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)的一種亞型，直到AQP4-IgG的發(fā)現，人們認識到NMO是一種獨立于MS的疾病，大部分NMO患者AQP4-IgG陽性，而MS患者則為陰性[10-11]。研究證實CXCR5或其臨位常見基因的變異與MS的發(fā)病相關[8]。亦有研究表明CYP7A1啟動子多態(tài)性、CD58基因多態(tài)性和STAT4多態(tài)性均與NMOSD的發(fā)病風險相關[12-14]。目前尚未檢索到CXCR5基因與NMOSD相關性研究的報道。本研究對中國漢族人群中CXCR5基因多態(tài)性與NMOSD發(fā)病風險的相關性進行了探討。

NMOSD是一種自身免疫介導的中樞神經系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，其核心的發(fā)病機制是自身免疫介導的組織損傷。有國外研究指出抗原特異性B細胞及T細胞發(fā)生免疫應答的基本結構是淋巴濾泡，其主要存在于次級淋巴組織或器官中，亦存在于自身免疫介導的慢性炎癥組織或器官內[15]。濾泡輔助性T細胞(TFH)和TFH相關分子可能參與了自身免疫性疾病的發(fā)病過程，CXCR5在TFH表面表達，并在其特異性受體選擇性B細胞趨化因子CXCL13的作用下遷移至B細胞，作用于B細胞生發(fā)中心，發(fā)揮體液免疫作用，對TFH和B細胞的激活、分化及存活都至關重要[16-17]。有研究發(fā)現血液中CXCR5+輔助性T細胞17(Th17)可能參與了抗體相關的免疫應答[18]。因此，作為TFH的標志物，CXCR5與自身抗體及自身免疫性疾病的相關產物有密切關系[9，19]，多項研究已經在MS、NMOSD、重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)以及其他一些自身免疫性疾病(如自身免疫性甲狀腺疾病、原發(fā)性干燥綜合征)的發(fā)病機制中證實了這一點[8，15-16]。在疾病的炎性反應過程中，外周活化的B細胞表達遲緩抗原-4(VLA-4)，并轉移至中樞神經系統(tǒng)；另外，CXCL13通過結合B細胞上的CXCR5，也將B細胞轉移至中樞神經系統(tǒng)，故NMO患者腦脊液中B細胞活化因子受體明顯升高[20]。

表2 NMOSD患者和健康對照組CXCR5 SNPs等位基因和基因型頻率

注：NMOSD：視神經脊髓炎譜系疾病，表3同；加性模型：aavs. Aavs.AA，顯性模型：aa+Aavs. AA，隱性模型：aavs.Aa+AA，其中a表示次要等位基因，A表示主要等位基因

圖 1 CXCR5 SNPs的連鎖不平衡的D’值(A)和r2(B)

單倍型NMOSD(頻率)健康對照(頻率)OR(95%CI)P值模塊 1C-G-A60(0.096)82(0.084)1.16(0.82^1.65)0.400C-G-G50(0.081)54(0.055)1.50(1.00^2.23)0.046T-A-G368(0.592)583(0.600)0.97(0.79^1.19)0.779T-G-G143(0.230)254(0.261)0.85(0.67^1.07)0.170模塊 2C-C82(0.131)110(0.113)1.19(0.88^1.61)0.269C-G68(0.109)104(0.107)1.02(0.74^1.41)0.890G-C474(0.760)760(0.780)0.89(0.70^1.13)0.336

注：模塊1：rs1574667-rs523604-rs118182497；模塊2：rs598207-rs676925

CXCR5基因編碼了趨化因子受體家族的多通道膜蛋白[9]。研究證實CXCR5 SNPs可改變B細胞的活性，從而增加患干燥綜合征和SLE的風險[21]。CXCR5 SNPs還可能改變核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NFKB)的結合，影響CXCR5基因的轉錄，進一步增加MS的發(fā)病風險[8]。作者推測，CXCR5 SNPs的這些影響也可能存在于NMOSD患者中。迄今為止，尚未檢索到CXCR5 SNPs與NMOSD發(fā)病風險關系的研究。本研究結果顯示，rs11574667的次等位基因C與NMOSD易感性相關，單倍型C-G-G也體現出相似的結果，初步證實CXCR5 SNPs在自身免疫介導的中樞神經系統(tǒng)疾病中的作用。然而，本研究存在以下不足：(1)由于NMOSD患者分為血清AQP4-IgG陽性和血清AQP4-IgG陰性(或未知的)，CXCR5 SNPs是否與AQP4-IgG的表達有關還需進一步研究。(2)CXCR5 SNPs與NMOSD臨床表型有無相關性尚需進一步研究。(3)本研究限于中國漢族人群，但NMOSD的發(fā)病具有種族差異。流行病學研究發(fā)現在亞洲和其他非白種人的發(fā)病率較高[22]。(4)NMOSD的發(fā)病受遺傳因素和環(huán)境因素相互作用，所以環(huán)境因素對其影響也有待進一步擴大樣本研究。這對NMOSD發(fā)病機制的研究具有重要意義。

綜上所述，本研究結果提示中國漢族人群中CXCR5 SNP rs11574667的次等位基因C及rs1574667-rs523604-rs118182497的單倍型C-G-G與NMOSD易感性相關，這可能對NMOSD發(fā)病機制的研究提供了新的思路，但有關兩者間確切關系尚需進一步研究。

[1]Wingerchuk DM，Banwell B，Bennett JL，et al.International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders[J]. Neurology，2015，85(2)：177-189.

[2]Akaishi T，Nakashima I，Sato DK，et al.Neuromyelitis optica spectrum disorders[J]. Neuroimag Clin N Am，2017，27(2)：251-265.

[3]Jarius S，Wildemann B.AQP4 antibodies in neuromyelitis optica： diagnostic and pathogenetic relevance[J]. Nat Rev Neurol，2010，6(7)：383-392.

[4]Ratelade J，Verkman AS.Neuromyelitis optica： aquaporin-4 based pathogenesis mechanisms and new therapies[J]. Int J Biochem Cell Biol，2012，44(9)：1519-1530.

[5]Lan W，Fang S，Zhang H，et al.The Fc receptor-like 3 polymorphisms(rs7528684，rs945635，rs3761959 and rs2282284) and the risk of neuromyelitis optica in a Chinese population[J]. Medicine(Baltimore)，2015，94(38)：e1320.

[6]Asgari N，Nielsen C，Stenager E，et al.HLA，PTPN22 and PD-1 associations as markers of autoimmunity in neuromyelitis optica[J]. Mult Scler，2012，18(1)：23-30.

[7]Yoshimine S，Sakai T，Ogasawara M，et al.Anti-aquaporin-4 antibody-positive familial neuromyelitis optica in mother and daughter[J]. Jpn J Ophthalmol，2011，55(6)：647-650.

[8]Lill CM，Schjeide BM，Graetz C，et al.MANBA，CXCR5，SOX8，RPS6KB1 and ZBTB46 are genetic risk loci for multiple sclerosis[J]. Brain，2013，136(6)：1778-1782.

[9]Zhang J，Zhang Y，Yang J，et al.Three SNPs in chromosome 11q23.3 are independently associated with systemic lupus erythematosus in Asians[J]. Hum Mol Genet，2014，23(2)：524-533.

[10]Lennon VA，Wingerchuk DM，Kryzer TJ，et al.A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica： distinction from multiple sclerosis[J]. Lancet，2004，364(9451)：2106-2112.

[11]Verkman AS，Phuan PW，Asavapanumas N，et al.Biology of AQP4 and anti-AQP4 antibody： therapeutic implications for NMO[J]. Brain Pathol，2013，23(6)：684-695.

[12]Kim HJ，Park HY，Kim E，et al.Common CYP7A1 promoter polymorphism associated with risk of neuromyelitis optica[J]. Neurobiol Dis，2010，37(2)：349-355.

[13]Liu J，Shi Z，Lian Z，et al.Association of CD58 gene polymorphisms with NMO spectrum disorders in a Han Chinese population[J]. J Neuroimmunol，2017，309：23-30.

[14]Shi Z，Zhang Q，Chen H，et al.STAT4 polymorphisms are associated with neuromyelitis optica spectrum disorders[J]. Neuromolecular Med，2017，19(4)：493-500.

[15]Aust G，Sittig D，Becherer L，et al.The role of CXCR5 and its ligand CXCL13 in the compartmentalization of lymphocytes in thyroids affected by autoimmune thyroid diseases[J]. Eur J Endocrinol，2004，150(2)：225-234.

[16]Fan X，Lin C，Han J，et al.Follicular helper CD4+T cells in human neuroautoimmune diseases and their animal models[J]. Mediators Inflamm，2015，2015(12)：1-11.

[17]Charbonneau B，Wang AH，Maurer MJ，et al.CXCR5 polymorphisms in non-Hodgkin lymphoma risk and prognosis[J]. Cancer Immunol Immunother，2013，62(9)：1475-1484.

[18]Li XY，Wu ZB，Ding J，et al.Role of the frequency of blood CD4(+) CXCR5(+) CCR6(+) T cells in autoimmunity in patients with Sjogren’s syndrome[J]. Biochem Biophys Res Commun，2012，422(2)：238-244.

[19]Moser B.CXCR5，the defining marker for follicular B helper T(TFH) cells[J]. Front Immunol，2015，6：296.

[20]Quan C，Yu H，Qiao J，et al.Impaired regulatory function and enhanced intrathecal activation of B cells in neuromyelitis optica： distinct from multiple sclerosis[J]. Mult Scler，2013，19(3)：289-298.

[21]Burbelo PD，Ambatipudi K，Alevizos I.Genome-wide association studies in Sjogren’s syndrome： What do the genes tell us about disease pathogenesis?[J]. Autoimmu Rev，2014，13(7)：756-761.

[22]Pandit L，Asgari N，Apiwattanakul M，et al.Demographic and clinical features of neuromyelitis optica： A review[J]. Mult Scler，2015，21(7)：845-853.