孫振儀，曹 芳，逄曉薇，丁 浩，陳紅巖，高 夏，劉曉娜，武 寧，吳媛媛

（中糧長城葡萄酒（煙臺）有限公司，山東蓬萊265600）

隨著人們生活水平的日益提高，人們對食品安全越來越重視。目前國內(nèi)葡萄酒市場的消費量也越來越大,葡萄酒中的添加劑也受到人們的重視。其中山梨酸、苯甲酸為防腐劑，在GB 15037《葡萄酒》中均有限量要求，而糖精鈉、安賽蜜為人工合成甜味劑，在食品工業(yè)中日益廣泛應(yīng)用，但在葡萄酒中不允許添加，然而在實際生產(chǎn)中不法商販超標(biāo)準(zhǔn)使用的現(xiàn)象時有發(fā)生，因此有必要加強對其監(jiān)管和檢測。使用液相色譜法，如果色譜實驗條件不合適，會導(dǎo)致葡萄酒一些物質(zhì)出峰時間與要檢測的4種物質(zhì)出峰時間相同，從而對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

GB 5009.28—2016為食品中山梨酸、苯甲酸和糖精鈉的測定通用方法，對于葡萄酒大批量樣品檢測時，前處理過程較復(fù)雜、耗時較長，本實驗針對葡萄酒中安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸和山梨酸的檢測方法進行實驗條件優(yōu)化，通過實驗減少了前處理的過程，節(jié)省時間及成本，對于葡萄酒生產(chǎn)、檢測等需對大批量葡萄酒樣品進行檢測的機構(gòu)，具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售葡萄酒樣品，葡萄酒經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

試劑：乙酸銨（色譜純），天津市光復(fù)精細化工研究所；甲醇（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氨水（色譜純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙酸（色譜純），天津市大茂化學(xué)試劑廠。

試劑配制：乙酸銨（20 mmol/L）溶液：稱取1.54 g乙酸銨，加入適量水中溶解，用水定容至1000 mL，用氨水或乙酸調(diào)整至合適的pH值，經(jīng)0.45 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：安賽蜜，安賽蜜溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)BW3510，1.00 mg/mL；糖精鈉（CA16901010,純度99.0%），精確稱取0.100 g糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，溶解轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，濃度為1.00 mg/mL；苯甲酸，苯甲酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100006，1.00 mg/mL；山梨酸，山梨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100007，1.00 mg/mL。

安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL至10 mL容量瓶中，加水定容,搖勻。配制成質(zhì)量濃度分別為0 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，臨用現(xiàn)配，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

儀器設(shè)備：Agilent1200型高效液相色譜儀（配自動進樣器、二極管陣列檢測器），Agilent公司；分析天平（感量0.0001 g），METTLER TOLEDO公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱：4.6×250 mm，粒徑5 μm；流動相：甲醇∶乙酸銨溶液=8∶92；流速：1 mL/min；檢測波長：230 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取條件和檢測項目優(yōu)化

國標(biāo)法GB 5009.28—2016適用于食品中糖精鈉、苯甲酸和山梨酸3種物質(zhì)的測定，通過加水提取，脫脂或經(jīng)蛋白沉淀劑沉淀蛋白，采用液相色譜分離、檢測。而葡萄酒的酒精度較低，在生產(chǎn)過程中要經(jīng)過下膠、下皂土等澄清步驟，成品酒中已除去了酒中不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)，葡萄酒可以直接進行液相色譜分離。而且增加安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后，安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸和山梨酸在現(xiàn)有條件下可以得到很好的分離度，因而采取對葡萄酒樣品不進行前處理，直接檢測4種物質(zhì)的方式。

2.2 色譜條件優(yōu)化

國標(biāo)法GB 5009.28—2016進行色譜分離時，使用的流動相為甲醇∶乙酸銨溶液=5∶95。但由于葡萄酒樣品內(nèi)容物質(zhì)眾多，背景干擾較大，最終選用流動相為甲醇∶乙酸銨溶液=8∶92。通過調(diào)整乙酸銨溶液的pH值，就可以很好地對待測4種物質(zhì)進行分離（如圖1、圖2、圖3、圖4）。

圖1 乙酸銨溶液pH4.81時4種物質(zhì)的混標(biāo)色譜圖

圖2 乙酸銨溶液pH5時4種物質(zhì)的混標(biāo)色譜圖

但在實際葡萄酒樣品檢測中，不同pH值的流動相對安賽蜜和糖精鈉的保留時間、峰高和峰寬的影響較小，但對山梨酸和苯甲酸的保留時間、峰高和峰寬的影響較大（如圖5、表1）。

根據(jù)實際色譜分離效果，選擇乙酸銨溶液pH5.20作為在葡萄酒樣品中檢測安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸和山梨酸的流動相條件，可以實現(xiàn)4種待測物質(zhì)與葡萄酒中其他化合物的分離，雜質(zhì)干擾少（如圖6、圖7、圖8、圖9）。

圖3 乙酸銨溶液pH5.2時4種物質(zhì)的混標(biāo)色譜圖

圖4 乙酸銨溶液pH5.4時4種物質(zhì)的混標(biāo)色譜圖

圖5 在不同pH值流動相下4種物質(zhì)的保留時間

表1 不同pH值流動相4種物質(zhì)的峰寬 (min)

圖6 乙酸銨溶液pH5.2時，紅葡萄酒空白樣品色譜圖

圖7 乙酸銨溶液pH5.2時，紅葡萄酒加標(biāo)樣品色譜圖

圖8 乙酸銨溶液pH5.2時，白葡萄酒空白樣品色譜圖

圖9 乙酸銨溶液pH5.2時，白葡萄酒加標(biāo)樣品色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別配制各組分濃度相等混合標(biāo)準(zhǔn)序列（20mg/L、50 mg/L、100 mg/L），進樣10 μL，以峰面積和濃度進行線性回歸，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見圖10、圖11、圖12、圖13。

圖10 安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法回收率和精密度實驗

以紅葡萄酒為例，分別吸取一定量（3個水平）的安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加酒定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，經(jīng)液相色譜分離、檢測，結(jié)果見表2。

由表2可知，加標(biāo)回收率在101.2%～106.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%～3.17%（n=5）。

圖11 糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖12 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)論

本研究在GB 5009.28—2016液相色譜法的基礎(chǔ)上改進檢測葡萄酒中安賽蜜、山梨酸、苯甲酸和糖精鈉的方法，使葡萄酒樣品可以直接進樣，同時檢測以上4種物質(zhì)。在流動相pH5.20時，即可較好分離被測物質(zhì)和葡萄酒中其他物質(zhì)，降低對檢測結(jié)果的干擾，得到了較為滿意的結(jié)果。

[1]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定：GB 5009.28—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.

[2]白靜.高效液相色譜法測定食品中的安賽蜜[J].食品科學(xué),2011,32(16)：245-248.

[3]河北省衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)食品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、糖精鈉和乙?；前匪徕洠ò操惷郏┑臏y定高效液相色譜法：DBS 13/006—2016[S].2016.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.飲料中乙酰磺胺酸鉀的測定：GB/T 5009.140—2003[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004.