高效液相色譜同時(shí)檢測白酒中四大酸的方法

王 芳，廖勤儉，安明哲，練順才，李楊華，郭 艷

(宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007)

乳酸、乙酸、丁酸、己酸是濃香型白酒中四大主體酸酯，即乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯的前體物質(zhì)，也是白酒香味成分。因乳酸為高沸點(diǎn)不揮發(fā)性酸，長期以來，此四大酸均參考國標(biāo)芐基溴酯化氣相色譜檢測方法[1]，此方法前處理時(shí)間長，影響檢測效率。另有離子色譜法測此4種酸[2]，該方法的應(yīng)用常出現(xiàn)乳酸和乙酸難以分離的問題，所以，針對白酒樣品，常常會進(jìn)行上百倍的稀釋，從而加大了檢測誤差，出現(xiàn)樣品檢測結(jié)果不穩(wěn)定的情況;也有以硫酸銅水溶液作為水相流動(dòng)相，利用高效液相色譜法測定白酒中乳酸和乙酸的方法[3]。白酒企業(yè)中，常規(guī)的酸酯醇檢測大多采用氣相色譜法，因此，為緩解氣相色譜的檢測壓力，以及離子色譜針對高酸濃度樣品的檢測不穩(wěn)定性，筆者利用高效液相色譜進(jìn)行了乳酸、乙酸、丁酸、己酸的檢測方法研究，并驗(yàn)證了方法在白酒酒尾樣品、己酸發(fā)酵液樣品檢測中的準(zhǔn)確性，特別是己酸發(fā)酵液中4種酸的檢測，可以監(jiān)控發(fā)酵的穩(wěn)定性及發(fā)酵過程的原料轉(zhuǎn)化率及己酸產(chǎn)率。研究結(jié)果表明，該方法簡便適用，精確度高，重復(fù)性好。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：白酒酒尾及己酸發(fā)酵液由本實(shí)驗(yàn)室自備。

乳酸、乙酸、丁酸、己酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制：準(zhǔn)確稱取色譜級乳酸、乙酸、丁酸、己酸，以70%的甲醇水溶液分別配制成50 mL濃度為10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液放置于4℃中冷藏。

試劑：優(yōu)級純磷酸、超純水、HPLC級甲醇。

儀器設(shè)備：美國Agilent公司1100高效液相色譜儀，DAD檢測器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Agela公司VenusilASB C184.6×250 mm，5 μm。

柱溫：30℃。

紫外線檢測波長：214 nm。

流動(dòng)相：A：甲醇；B：0.1%的磷酸水溶液。

梯度洗脫：0 min：100 B；8 min：100 B；25 min：10 B；28.5 min：10 B；29 min：100 B；35 min：100 B；停止：35 min；流速：1.0 mL/min。

1.2.2 樣品前處理

白酒酒尾樣品：取0.5 mL白酒樣品以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1 mL，于2 mL離心管中，振蕩均勻，0.2 μm的膜過濾后作為待測樣品。

己酸發(fā)酵液：取0.1 mL己酸發(fā)酵液，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1 mL，于2 mL離心管中，振蕩均勻，0.2 μm的膜過濾后作為待測樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)樣的檢測

分別取10 g/L的4種酸單標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行定性檢測。標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖見圖1，4種酸的出峰時(shí)間見表1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

表1 4種酸的出峰時(shí)間

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

分別取10 mg/L的4種酸單標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至100 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L、2000 mg/L，5個(gè)濃度梯度，作為定量分析校正。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（mg/L）為X橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，檢測結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

2.3 白酒酒尾樣品中4種酸的精密度、回收率

取白酒酒尾樣品，其中一份經(jīng)1.2.2中方法處理后，作為空白樣品；另兩份分別加入已知量的4種酸單標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)1.2.2中方法處理后，進(jìn)行回收率測定；同時(shí)對空白樣品進(jìn)行精密度測定，檢測結(jié)果見表3。白酒酒尾空白樣品色譜圖見圖2。

圖2 白酒酒尾空白樣品色譜圖

2.4 己酸發(fā)酵液樣品中4種酸的精密度、回收率

取己酸發(fā)酵液樣品，其中一份經(jīng)1.2.2中方法處理后，作為空白樣品；另兩份分別加入已知量的4種酸單標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)1.2.2中方法處理后，進(jìn)行回收率測定；同時(shí)對一加標(biāo)樣品進(jìn)行精密度測定，檢測結(jié)果見表4。

表3 白酒酒尾樣品中4種酸檢測結(jié)果

表4 己酸發(fā)酵液樣品中4種酸檢測結(jié)果

3 結(jié)果與討論

該方法中水相流動(dòng)相中加入適量的磷酸有助于乳酸和乙酸的分離和保證樣品檢測的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。方法中白酒酒尾樣品，酒精度在15%vol左右，樣品中乙醇的濃度對乙酸和乳酸的分離有影響，經(jīng)磷酸水溶液稀釋后，能保證樣品中乳酸峰和乙酸峰的有效分離。己酸發(fā)酵液樣品中乙酸、丁酸、己酸濃度相對較高，且含有一定的鈣鹽、鈉鹽，經(jīng)磷酸水溶液進(jìn)行十分之一的稀釋，可以將溶液中的有機(jī)酸鹽轉(zhuǎn)化成酸，保證樣品檢測的準(zhǔn)確性。

方法采用214 nm的DAD檢測波長，梯度洗脫的方式,隨著流動(dòng)相中有機(jī)相濃度的增高，基線有一定的向上漂移，但對樣品中4種酸的定性定量檢測沒有影響。

方法中，4種酸的定量檢測限均為10 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)R2值為0.9996～0.9999，白酒酒尾樣品中的回收率為94.3%～100.5%，檢測結(jié)果的RSD為1.29%～3.67%。己酸發(fā)酵液樣品中的回收率為96.6%～101.9%，檢測結(jié)果的RSD為1.28%～3.02%，滿足分析要求。

該方法簡單、適用，可以緩解白酒企業(yè)氣相色譜和離子色譜的檢測壓力。

[1]中國輕工業(yè)聯(lián)合會.食品添加劑乳酸：GB 2023—2003[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

[2]郭逸臻,石敏.離子色譜法測定白酒中乳酸含量的方法研究[J].釀酒科技,2008(9)：108-110.

[3]馮向東.高效液相色譜法測定白酒中乳酸和乙酸含量[J].釀酒科技,2009(5)：115-116.