王小爽，于 姍，何金蓉，余 佳

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

在成體中，造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSC)位于一系列多等級(jí)不同方向的始祖細(xì)胞的頂端，其下游的各種不同定向的始祖細(xì)胞經(jīng)過(guò)各自的分化， 最終形成了造血系統(tǒng)中各類具有明確功能的分化末端細(xì)胞[1]。多能始祖細(xì)胞分為共同淋巴樣祖細(xì)胞(common lymphoid progenitors, CLP)以及共同髓樣祖細(xì)胞(common myeloid progenitors, CMP)。CMP進(jìn)一步分化為巨核系/紅系祖細(xì)胞(megakaryocyte-erythroid progenitor cells, MEP)以及粒系/單核系祖細(xì)胞(granulocyte-macrophage progenitors, GMP)[2]。GMP最終分化產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞對(duì)于對(duì)抗病原體入侵和識(shí)別損傷組織裂解后的細(xì)胞碎片非常重要[3]。在這些多級(jí)、多向的分化過(guò)程中，細(xì)胞中也經(jīng)歷了一系列復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控事件，精確而準(zhǔn)時(shí)地控制細(xì)胞的自我更新、增殖和分化。當(dāng)正常造血分化中的調(diào)控發(fā)生異常時(shí)，常導(dǎo)致血液系統(tǒng)腫瘤的產(chǎn)生，包括急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)[4]。本研究旨在分析RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein, RBP)KSRP在AML中的表達(dá)情況，明確KSRP調(diào)控AML發(fā)展的機(jī)制，從而初步探索KSRP在異常造血中的生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

Western blot及IP細(xì)胞裂解液、DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；293T和THP- 1細(xì)胞(ATCC)抗兔KSRP抗體[Abcam(上海)公司]；抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RPMI- 1640、DMEM和進(jìn)口胎牛血清(Thermo-Fisher公司)；RT-qPCR試劑(Takara公司)；構(gòu)建質(zhì)粒所需的內(nèi)切酶(NEB公司)；細(xì)胞增殖(Cell Counting Kit- 8，CCK- 8)和凋亡檢測(cè)試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司)；CD14分選磁珠和磁柱(德國(guó)美天旎生物公司)；EasySepTMHuman Neutrophil Enrichment Kit(Stemcell公司); ApoLive-GloTMMultiplex Assay (Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 外周血中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的分離：采用正常人外周血白細(xì)胞層樣品(50 mL)。本研究已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)書，由于使用的是血液中心的報(bào)廢樣品，已經(jīng)申請(qǐng)免除知情同意書。

利用Ficoll分離白細(xì)胞樣品，隨后利用CD14分選磁珠對(duì)淋巴細(xì)胞-單核細(xì)胞層的細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性篩選，將分選得到的細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6 h，收集貼壁細(xì)胞。對(duì)于紅細(xì)胞-粒細(xì)胞層，裂解紅細(xì)胞后300×g離心收集細(xì)胞沉淀。隨后利用EasySepTMHuman Neutrophil Enrichment Kit中的磁珠和抗體進(jìn)行分選，收集陰性篩選得到的細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)mRNA：Trizol法提取細(xì)胞總RNA。測(cè)定RNA樣品的濃度和純度，A260/A280值在1.80～2.00。M-MLV合成cDNA第一鏈。使用3’-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為相對(duì)定量的內(nèi)參基因，每個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)總體積為20 μL。程序如下：94 ℃ 10 s；58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共50個(gè)循環(huán)；94 ℃ 15 s，64 ℃～94 ℃，緩慢升溫，產(chǎn)生熔解解離曲線。RT-qPCR用到的引物見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Primers for RT-qPCR

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.3.1 miRNA過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建：從基因組模板中PCR擴(kuò)增700 bp左右的miR- 129初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，切膠回收目的片段。將pMIRNA1空載體和純化得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，切膠回收酶切好的載體片段和目的DNA片段，進(jìn)行連接。

1.2.3.2 shRNA載體的構(gòu)建：通過(guò)shRNA干擾片段在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/以及KSRP的干擾序列，設(shè)計(jì)兩條shRNA，并在shRNA兩端連接相應(yīng)的酶切位點(diǎn)黏性末端。序列由天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成。合成的片段退火,退火得到的片段與pSIH-H1載體連接。

1.2.4 細(xì)胞系培養(yǎng)：將THP- 1細(xì)胞懸于 RPMI1640完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中，293T細(xì)胞放入DMEM完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 慢病毒制備和細(xì)胞感染：使用Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后，收集培養(yǎng)上清。0.45 μm濾膜過(guò)濾，4 ℃、20 000 r/min離心2.5 h，進(jìn)行病毒顆粒的收集。棄上清，使用下游感染所需細(xì)胞培養(yǎng)基重懸病毒顆粒并分裝，凍存于-80 ℃。慢病毒感染當(dāng)天，將THP- 1細(xì)胞鋪入6孔板。將病毒液加入細(xì)胞中，然后加入polybrene。細(xì)胞孵育過(guò)夜，感染12～16 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基。

1.2.6 Western blot檢測(cè)KSRP蛋白：收集細(xì)胞并使用Western及IP細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白樣品，每個(gè)樣品上樣量為20 μg。隨后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入抗兔KSRP一抗孵育過(guò)夜，隨后加入抗兔二抗，室溫孵育1 h。DAB法顯影，分析蛋白表達(dá)。

1.2.7 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖:在96孔板中配置100 μL的細(xì)胞懸液，每孔的細(xì)胞數(shù)量為3 000～5 000個(gè)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37℃，5% CO2)。向培養(yǎng)板加入10 μL CCK8，在培養(yǎng)箱孵育4 h，不要在孔中生成氣泡。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將PBS清洗后的細(xì)胞重懸于100 μL的1×結(jié)合緩沖液中，分別加入加5 μL 熒光標(biāo)記的Annexin V和PI染色液。室溫避光孵育15 min。細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾去掉成團(tuán)的細(xì)胞，然后快速上流式細(xì)胞儀BD Accuri C6檢測(cè)，結(jié)果使用C6的軟件進(jìn)行分析。

1.2.9 ApoLive-GloTMMultiplex Assay試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡：在96孔板中配置100 μL的細(xì)胞懸液，每孔的細(xì)胞數(shù)量為3 000～5 000個(gè)。培養(yǎng)細(xì)胞72 h后，每孔加入20 μL活性檢測(cè)試劑。水平輕微震蕩后，在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)30 min(37 ℃，5% CO2)，檢測(cè)在400 nm激發(fā)光/505 nm發(fā)射光處的吸光度值。每孔加入100 μL Caspase-Glo? 3/7 Reagent，水平輕微震蕩后，在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)30 min(37 ℃，5% CO2)，檢測(cè)螢光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 KSRP在外周血中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)不同

取3名正常人外周血的中性粒和單核細(xì)胞。KSRP mRNA在其中2名中具有相似的表達(dá)情況，即在中性粒細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于單核細(xì)胞(P<0.05)(圖1)。在#3中KSRP呈現(xiàn)在單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中幾乎相同的表達(dá)水平。由于KSRP在髓系細(xì)胞中促進(jìn)miR- 129的加工[5]，進(jìn)而在這3名正常人樣品中檢測(cè)了miR- 129的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在2名正常人樣本中均與KSRP一致(P<0.001)(圖1)。

*P<0.05， **P<0.001 compared with monocytes圖1 KSRP和miR- 129在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的表達(dá)Fig 1 KSRP和miR- 129 expression in granulocytes and n=3)

2.2 KSRP在特定AML群體中具有表達(dá)差異

KSRP在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的顯著變化提示該蛋白可能在不同類型的AML中具有差異表達(dá)，因而在最常見(jiàn)4類異常核型AML、正常核型AML(normal)和正常對(duì)照(NC)中分析KSRP的表達(dá)。首先利用同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室來(lái)源的GSE34184和GSE30285兩套數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)KSRP在4類核型異常AML患者中均異常上調(diào)。并且KSRP在混合譜系白血病(MLL)易位AML(M5型)中的表達(dá)水平顯著高于t(15;17) 急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)患者(圖2)。利用Bloodspot的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析[6]，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照相比，KSRP僅在MLL易位AML(包括M4和M5型)中顯著上調(diào)，并且KSRP在t(15;17) APL中的表達(dá)水平顯著低于其在MLL易位和t(8;21)病例中的表達(dá)(圖2)。最后，在包括了GSE13159、GSE15434、 GSE61804、GSE14468和TCGA 5個(gè)數(shù)據(jù)集合共1 299例AML患者的Bloodpool數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)一步分析KSRP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在t(15;17) APL中KSRP的表達(dá)水平顯著低于其他類型AML(圖2)。綜上，KSRP在t(15;17) APL中低表達(dá)，而在MLL易位的急性單核細(xì)胞白血病或急性粒-單核細(xì)胞白血病中高表達(dá)。

KSRP expression analyzed in GSE34184 and GSE30295(A), bloodspot(B), bloodspool(C) database, respectively;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001 compared with the indicated controls

圖2KSRP在AML患者中的表達(dá)

2.3 抑制內(nèi)源KSRP的表達(dá)減緩了AML細(xì)胞的增殖

KSRP可能在AML-M5型中發(fā)揮原癌基因的功能，因此利用AML-M5來(lái)源的THP- 1細(xì)胞進(jìn)行功能研究。在THP- 1細(xì)胞中，構(gòu)建的兩條位點(diǎn)特異的shRNA均能顯著在蛋白和RNA水平抑制KSRP的表達(dá)(P<0.05)(圖3)，可以用于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。抑制KSRP的表達(dá)導(dǎo)致THP- 1細(xì)胞增殖受阻(P<0.01)，凋亡顯著增加(P<0.01)(圖4)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with pSIH

2.4 過(guò)表達(dá)miR- 129促進(jìn)了AML細(xì)胞的增殖

由于miR- 129位于KSRP下游，miR- 129可能與KSRP具有相似的功能。在THP- 1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR- 129，使細(xì)胞中miR- 129的水平顯著增加(圖5A)。隨后分兩步分別檢測(cè)存活細(xì)胞的數(shù)量以及以caspase活性為標(biāo)志的細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示培養(yǎng)72 h后，miR- 129顯著促進(jìn)了細(xì)胞增殖(P<0.05)(圖5B)，但是對(duì)細(xì)胞凋亡的影響不顯著(圖5C)。

*P<0.01, **P<0.001 compared with pSIH圖4 KSRP對(duì)THP- 1增殖和凋亡的影響Fig 4 Effect of KSRP on cell proliferation and apoptosis in THP- 1 n=3)

A.analysis of miR- 129 expression in THP- 1 cells; B.miR- 129 overexpression promoted cell viability; C.cell apoptosis was not affected by miR- 129 overexpression;*P<0.05 compared with pMIRNA1

圖5miR-129對(duì)THP-1增殖和凋亡的影響

3 討論

在過(guò)去十幾年中， 人們對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)逐漸深入， RBP位于這一網(wǎng)絡(luò)的中心位置。RBP參與RNA加工的多個(gè)過(guò)程，包括選擇性剪接、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定性維持、RNA定位以及mRNA的翻譯等[7]。根據(jù)RBP結(jié)合的RNA或者發(fā)揮作用的生物環(huán)境不同，RBP的調(diào)控作用可能是正向或者負(fù)向的。研究發(fā)現(xiàn)RBP的表達(dá)變化或者RNA結(jié)合位點(diǎn)的突變可以導(dǎo)致多種疾病，包括遺傳疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及癌癥[8]。研究發(fā)現(xiàn)KSRP能夠促進(jìn)CD34+造血干/祖細(xì)胞的粒系分化而抑制單核分化，并且KSRP通過(guò)促進(jìn)miR- 129初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的加工而發(fā)揮其在髓系分化中的調(diào)控功能[5]。在免疫系統(tǒng)中的研究也發(fā)現(xiàn)KSRP可以通過(guò)其KH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合促進(jìn)一系列miRNA的成熟，并且KSRP這種調(diào)控可能發(fā)生在miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本或前體兩個(gè)階段[9- 10]。

在本研究中，KSRP與miR- 129均在中性粒細(xì)胞中顯著高表達(dá)于單核細(xì)胞。在AML病例中的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照相比，KSRP在MLL易位的M4和M5型AML中穩(wěn)定地高表達(dá)；相反地，t(15;17) APL中KSRP的表達(dá)總是低于其他類型的AML。臨床診斷上M4和M5型AML主要表現(xiàn)為原始或幼稚單核細(xì)胞異常增加[11]，因而KSRP的異常高表達(dá)可能與單核細(xì)胞AML的發(fā)生相關(guān)。對(duì)KSRP的功能研究發(fā)現(xiàn)KSRP能夠促進(jìn)THP- 1的增殖，并且miR- 129在THP- 1中的功能與KSRP相似。綜上，KSRP可能通過(guò)促進(jìn)miR- 129的成熟增加AML- M5細(xì)胞的增殖能力，從而發(fā)揮原癌基因的功能。

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