陳 樺，李 靜，趙春華

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 組織工程中心, 北京 100005)

美國癌協(xié)會2017年發(fā)表的最新癌統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：在女性中最常見的癌中，乳腺癌發(fā)病率已居女性惡性腫瘤首位[1]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。微環(huán)境中的炎性因子可以誘導循環(huán)的MSCs和在相鄰組織中的MSCs歸巢到腫瘤中，在微環(huán)境中多種因子的刺激下以腫瘤相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)的形式參與了微環(huán)境中細胞基質(zhì)的組成[2]。

本實驗室前期初步研究發(fā)現(xiàn)利用乳腺癌細胞系MCF- 7與MSCs共培養(yǎng)為模型來模擬腫瘤微環(huán)境， MSCs可以通過分泌TGF-β等因子誘導MCF- 7細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transi-tion，EMT)，提高腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[3]。本實驗旨在進一步探討腫瘤細胞對MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化的影響及發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵分子。通過表達譜芯片分析MCF- 7細胞與MSCs共培養(yǎng)后不同時間點的基因表達譜，共培養(yǎng)后MCF- 7中miR- 210的表達持續(xù)上升。miR- 210是細胞缺氧后反應變化最為靈敏的miRNAs 之一，也有文獻報道稱miR- 210的上調(diào)與腫瘤的產(chǎn)生有密切聯(lián)系[4]。因此，本研究提出假設：乳腺癌細胞通過上調(diào)miR- 210的表達，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化，以促進腫瘤的生長。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：DMEM、 D/F- 12、RPMI 1640和胎牛血清(Gibco公司)；青霉素和鏈霉素(PS)(華北制藥股份有限公司)；膠原酶P(Roche公司)；細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000TM(Invitrogen 公司)；miR- 210 的模擬物和抑制劑、CAFs相關(guān)特征標志物引物(上海生工生物工程有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；山羊抗兔、山羊抗鼠IgG(碧云天生物有限公司)；多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.2 細胞和動物：細胞：成人脂肪來源間充質(zhì)干細胞(hAD-MSCs)取自中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院吸脂術(shù)患者廢棄的脂肪組織分離獲得。本研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所倫理委員會批準，供者均簽訂知情同意書。MCF- 7、MDA-MB- 231細胞(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心)。

1.1.3 動物：SPF級健康雌性BALB/ c-nu小鼠10只，4～6周齡，質(zhì)量20～25 g(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所動物中心，合格證號：11804700014616)

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人脂肪MSCs提取和培養(yǎng)的方法參見文獻[3]。

1.2.2 hAD-MSCs與乳腺癌細胞系共培養(yǎng)：將乳腺癌細胞系與MSCs常規(guī)消化后用腫瘤培養(yǎng)基重懸，分別接種到帶小室的Transwell 6孔板中，接種約為2×105個/孔，腫瘤培養(yǎng)基補齊到2 000 μL。

1.2.3 miR- 210- 3p及對照的瞬時轉(zhuǎn)染和慢病毒介導的感染：MCF- 7、MDA-MB- 231的瞬時轉(zhuǎn)染用Lipofectamine 2000按照說明書進行。慢病毒介導的感染由上海吉瑪公司合成、包裝，按說明書進行。用Lipofectamine 2000向乳腺癌MDA-MB- 231細胞轉(zhuǎn)miR- 210- 3p抑制劑及對照miR- NC，轉(zhuǎn)染后的細胞命名為MDA-MB- 231-miR- NC和MDA-MB- 231-miR- 210-inhibitor，共培養(yǎng)體系備用；用慢病毒向乳腺癌MCF- 7細胞轉(zhuǎn)miR- 210- 3p抑制劑及對照LV- 3，感染后的細胞命名為MCF- 7-miR- NC和MCF- 7-miR- 210- inhibitor，動物實驗備用。

1.2.4 RT-qRCR檢測： 1)共培養(yǎng)不同時間點(0、3、6和9 d)收集的乳腺癌MCF- 7和MDA-MB- 231細胞中miR- 210的表達情況。miRNA引物序列見表1;2)共培養(yǎng)后MSCs向腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAFs)轉(zhuǎn)化的情況，檢測CAFs相關(guān)特征標志物包括α-SMA、FAPA、tenascin-c mRNA的表達(表2)。

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測：CAFs相關(guān)特征標志物的蛋白水平檢測方法參見文獻[3]。

1.2.6 動物分組及處理： 4 ～6周雌性裸鼠10只，隨機分為MCF- 7-miR- 210-inhibitor組和MCF- 7-miR- NC組，每組5只。將慢病毒感染miR- 210抑制劑和對照LV- 3的MCF- 7( MCF- 7-miR- 210-inhibitor細胞和MCF- 7-miR- NC細胞)分別與hAD-MSCs按1∶1比例(每只裸鼠接種5×106細胞)混合皮下注射到免疫缺陷的裸鼠的背部。各組動物經(jīng)過上述處理后,每周定期觀察裸鼠的生長狀況,用游標卡尺對瘤體的長度(L)、寬度(W)進行測量，4周后取出腫瘤組織，測量腫瘤體積和質(zhì)量。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primer sequences for real-time PCR

表2 CAFs相關(guān)特征標志物Real-time PCR引物Table 2 Primer sequence of CAFs characteristic markers

1.2.7 腫瘤組織分離培養(yǎng)與檢測：將小鼠皮下腫瘤組織取出放入PBS中。在超凈臺中用含有雙抗的無菌PBS清洗2次。用手術(shù)剪刀將組織剪成顆粒狀。加入0.20 %膠原酶P，置于37 ℃搖床，慢搖30～60 min，用D-Hank’s終止消化。100目篩網(wǎng)過濾， 1 500 r/min，離心10 min ，棄去上清，保留最下面的細胞沉淀。用少量D-Hank’s重懸, 再次離心后棄去上清，加入(DMEM+10% FBS)培養(yǎng)基，輕輕吹打后移入T75培養(yǎng)瓶中。差速貼壁法，1 h后換成新的培養(yǎng)基。次日觀察細胞的貼壁情況。從兩組小鼠腫瘤組織分離培養(yǎng)的細胞，MCF- 7-miR- NC組共有5組分別NC- 1、NC- 2、NC- 3、NC- 4和NC- 5；MCF- 7-miR-210-inhibitor組共有5組分別為i- 1、 i- 2、i- 3、i- 4和i- 5。RT-qPCR和Western blot檢測細胞α-SMA、FAPA 和波形蛋白(vimentin)的表達，內(nèi)參為GAPDH。

1.2.8 HE染色：免疫組織化學觀察腫瘤組織中CAFs相關(guān)標記物α-SMA和vimentin的染色情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 hAD-MSCs和乳腺癌細胞系(BCCs)共培養(yǎng)后BCCs持續(xù)上調(diào)miR- 210的表達

在人脂肪來源hAD-MSCs與乳腺癌細胞系(MCF- 7、MDA-MB- 231)分別共培養(yǎng)0、3、6和9 d后，MDA-MB- 231細胞miR- 210表達顯著上調(diào)(P<0.05)(圖1A)；與hAD-MSCs共培養(yǎng)不同時間點后，MCF- 7細胞miR- 210表達也顯著上調(diào)(P<0.05)(圖1B)。

2.2 共培養(yǎng)條件下促使 MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化

與乳腺癌MDA-MB- 231細胞共培養(yǎng)(0、3、6、12、15及21 d)后， MSCs中肌動蛋白α-SMA mRNA及腱生蛋白tenascin-c mRNA的表達量明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2A,B)；共培養(yǎng)后的MSCs中平滑肌肌動蛋白α-SMA和成纖維細胞活化蛋白-α(FAPA)的蛋白表達也是上調(diào)的(P<0.05)(圖3)。

A.expression of miR- 210 in MDA-MB- 231 after co-culture; B.expression of miR- 210 in MCF- 7 after co-culture; *P<0.05，**P<0.01 compared with untreated MCF- 7 or MDA-MB- 231(0 day)

A.expression of α-SMA in co-MSCs after co-culture; B.expression of tenascin-c in co-MSCs after co-culture;*P<0.05,**P<0.01 compared with untreated MSCs(0 day)

圖2RT-qPCR檢測共培養(yǎng)后MSCs中α-SMA、tenascin-c的mRNA表達

*P<0.05, **P<0.01 compared with untreated MSCs(0 day)圖3 Western blot檢測MDA-MB- 231與MSCs共培養(yǎng)0、3、6及9 d的α-SMA和FAPA蛋白表達Fig 3 Expression of α-SMA, FAPA in MDA-MB- 231 co-cultured with MSCs by Western

2.3 共培養(yǎng)中抑制乳腺癌細胞系miR- 210可以抑制共培養(yǎng)中MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)miR- 210-3p抑制劑及對照miR- NC后的乳腺癌MDA-MB- 231細胞(實驗分組為：MDA-MB- 231-miR- NC組和MDA-MB- 231-miR- 210-inhibitor組)，再與同比例hAD-MSCs共培養(yǎng)，檢測CAFs相關(guān)特征標志物的α-SMA、tenascin-c基因表達的改變(P<0.05)。與 MDA-MB- 231-miR- NC組相比，不同時間點(3、6及9 d)檢測 MDA-MB- 231-miR- 210-inhibitor組的α-SMA和tenascin-c基因表達水平下調(diào)(圖4)。

2.4 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗

與對照組MCF- 7-miR- NC相比， MCF- 7-miR- 210-inhibitor組腫瘤組織的體積和質(zhì)量較小(圖5)；免疫組化檢測顯示MCF- 7-miR- 210-inhibitor組CAFs相關(guān)的α-SMA和FAPA較MCF- 7-miR- NC組顯著下調(diào)(圖6)；MCF- 7-miR- 210-inhibitor組中α-SMA、FAPA的基因表達較對照組MCF- 7-miR- NC也顯著下調(diào)(圖7)。從腫瘤組織分離的細胞中α-SMA、FAPA和vimentin的蛋白表達和基因結(jié)果一致。

3 討論

MSCs具有自我更新和多向分化潛能,可向腫瘤局部遷移[5],受腫瘤微環(huán)境影響向 CAFs轉(zhuǎn)化。CAFs作為腫瘤微環(huán)境中的重要細胞成分，不僅僅是被動的為腫瘤生長提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)，更積極主動參與誘導上皮細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。CAFs 通過與周圍細胞相互作用和分泌各種促癌因子(包括細胞因子、趨化因子和多種炎性介質(zhì))促進腫瘤生長[7- 8]。

在正常和缺氧條件下研究miR- 210對癌細胞系中線粒體功能的影響， 發(fā)現(xiàn)miR- 210降低線粒體功能并上調(diào)糖酵解，從而使癌細胞對糖酵解抑制劑更敏感[9]。在缺氧狀態(tài)下，miR- 210是導致ISCU1/2和COX10基因下調(diào)的主要原因。miR- 210作為腫瘤缺氧反應變化最敏銳的指標，與許多腫瘤的不良預后直接相關(guān)[10]。

A.expression of tenascin-c in MSCs co-culture with inhibition of BCCs miR- 210; B.expression of α-SMA in MSCs co-culture with inhibition of BCCs miR- 210;*P<0.05，**P<0.01 compared with MDA-MB-231-miR-NC group(3 days)

圖4RT-qPCR檢測BCCs轉(zhuǎn)miR-210抑制劑后CAFs的表達

A.tumor volume of MCF- 7-miR- NC group and MCF- 7-miR- 210-inhibitor group; B.average quality of MCF- 7-miR- NC group and MCF- 7-miR- 210-inhibitor group；*P<0.05; compared with MCF- 7-miR- NC group

圖5抑制乳腺癌MCF-7細胞miR-210的表達后降低腫瘤生長

A.α-SMA mRNA expression in tumor tissues; B.FAPA mRNA expression in tumor tissues;*P<0.05，**P<0.01 compared with MCF- 7-miR- NC group

圖7RT-qPCR和Westernblot檢測腫瘤組織中CAF的mRNA和蛋白水平

在體外實驗中，已經(jīng)得出MSCs和BCCs共培養(yǎng)后BCCs中miR- 210的表達持續(xù)上調(diào)；miR- 210高表達促使MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化；miR- 210在共培養(yǎng)體系中起到關(guān)鍵分子的作用，抑制腫瘤中miR- 210表達可抑制腫瘤的生長和腫瘤細胞的增殖。結(jié)合體內(nèi)動物成瘤實驗進一步證實miR- 210參與調(diào)控腫瘤的生長。在接下來的研究中，將主要圍繞共培養(yǎng)前后MSCs以及CAFs多種分泌因子的改變、代謝方式的改變，以及是否通過下調(diào)ISCU1/2靶基因的來發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，miR- 210能夠參與調(diào)控MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化，進而促進腫瘤的生長。期待通過進一步的工作充分驗證miR- 210作為乳腺癌早期診斷的特異性標記，并將其發(fā)展為腫瘤特異性靶向治療一個有效的新靶點。本研究也有望應用于對乳腺癌患者的臨床診斷與預后評判，可能會對乳腺癌的臨床治療提供有價值的幫助。

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