陳坤杰 季方芳 徐佳琪

(南京農(nóng)業(yè)大學工學院， 南京 210031)

0 引言

牛肉的品質(zhì)包括嫩度、顏色和風味[1-2]等,是決定牛肉銷售價格及消費者采購意向的主要因素。其中,牛肉的嫩度主要反映了其質(zhì)地及食用時的口感,是決定消費者購買意向的最主要因素。影響牛肉嫩度的因素主要有牛肉的品種、生理成熟度(牛齡)以及宰殺方式等。肌纖維是組成肌肉的基本單位,研究發(fā)現(xiàn),肌纖維特征是描述肉品質(zhì)形成機理的一個重要的定量指標[3],不僅可以用來評定肉的嫩度,而且與肉的顏色、肉表面紋理特征、pH值等密切聯(lián)系。DAVIS等[4]發(fā)現(xiàn)，肌纖維肌節(jié)長度越長,肉質(zhì)越嫩;CENA等[5]的試驗研究也得出了類似的結(jié)論;KLONT等[6]的研究證明,肌肉的肌纖維類型與牛肉的嫩度具有顯著的相關(guān)性。牛蕾等[7-9]發(fā)現(xiàn),不同品種的牛肉,其肌纖維特性明顯不同。其中,肌纖維直徑作為肌纖維特性中的一個重要因素,其大小與牛肉嫩度密切相關(guān)。文獻[10-15]分別對豬肉的肌纖維直徑與肉質(zhì)嫩度的關(guān)系進行了研究,發(fā)現(xiàn)肌纖維直徑與豬肉嫩度之間具有顯著的相關(guān)性。孫竹瓏[16]研究了藏山羊的組織學特性, 結(jié)果表明，藏山羊的肌纖維直徑與嫩度呈負相關(guān),直徑愈小,肉質(zhì)愈嫩。其中,影響肌纖維直徑粗細的主要因素是羊的品種、年齡、運動量和營養(yǎng)狀況等。肌纖維密度是影響牛肉嫩度的另一個相關(guān)因素。吳信生等[17]研究了我國7個不同地方雞種的組織學特性,發(fā)現(xiàn)肌纖維密度與肌肉嫩度的相關(guān)性較高,7個地方雞種肌纖維密度與嫩度都呈負相關(guān)。王亞鳴等[18]、沈元新等[19]對骨骼肌纖維進行了研究,結(jié)果表明，骨骼肌纖維直徑越小,肌纖維密度越大,二者呈負相關(guān)。陳騁等[20]通過研究凍融次數(shù)對牛肉肌內(nèi)蛋白含量的影響發(fā)現(xiàn),牛肉肌纖維結(jié)構(gòu)破壞程度隨凍融次數(shù)增加而增加,凍融加劇汁液流失,影響牛肉的嫩度品質(zhì)。孫竹瓏等[21]、楊博輝等[22]分別研究了不同年齡組、不同品種的牦牛肌纖維與結(jié)締組織的體積比,發(fā)現(xiàn)隨年齡增長,牦牛肌內(nèi)肌纖維含量呈下降趨勢,而結(jié)締組織含量呈上升趨勢,肌纖維的比例越大,肉質(zhì)越嫩。

盡管牛齡是影響牛肉品質(zhì)的重要因素,也是牛肉質(zhì)量分級的重要參考指標，但牛齡與牛肉嫩度之間的關(guān)系并不明確,不同牛齡牛肉的微觀結(jié)構(gòu)特征以及這些結(jié)構(gòu)特征與牛肉嫩度之間的相關(guān)性研究,目前還沒有報道。本文通過圖像分析技術(shù),測量不同牛齡牛肉肌纖維的直徑、周長和密度,研究不同牛齡牛肉肌纖維的直徑、周長和密度與牛肉剪切力之間的關(guān)系,從微觀結(jié)構(gòu)的角度,研究分析影響牛肉嫩度的因素,為牛肉品質(zhì)分級提供一定的技術(shù)基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

試驗樣本選自吉林省長春皓月清真肉業(yè)股份有限公司肉牛育肥場的雜交沃金黑牛,分別選取18、36、54、72月齡已經(jīng)閹割過的公牛各25頭,共100頭。在長春皓月屠宰場內(nèi)經(jīng)過宰殺、放血、去牛蹄內(nèi)臟、剝皮、劈半、沖洗、胴體吊掛、72 h排酸后,選取背最長肌經(jīng)-30℃速凍后,運往實驗室冰柜在-18℃下冷凍備用。其中80個用于試驗,20個用于模型驗證。

試驗試劑主要有液氮(南京龍盛特種氣體有限公司)和蘇木素- 伊紅(H- E)染色液(包括核染液、漿染液,南京建成科技有限公司)。

1.2 試驗儀器和設備

CM1990型冷凍切片機(德國Leica公司);ScopeA1型正置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司);TMS- PRO型質(zhì)構(gòu)儀(美國FTC公司);M30- H2型圓形鉆孔取樣器(直徑1.5 cm,哈爾濱量具刃具集團有限公司);HH- 1型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市城東超韻實驗儀器廠);DT- 612型熱電偶測溫儀(探頭直徑小于2 mm,深圳華盛昌機械實業(yè)有限公司)。

1.3 牛肉嫩度的測定

根據(jù)文獻[23],牛肉的剪切力(反映牛肉嫩度，剪切力越低，表示嫩度越高)測量步驟如下:①將冷凍的肉樣置于常溫下解凍,直至中心溫度達到0～4℃。②將肉樣置于蒸煮袋中,將熱電耦測溫儀的探頭插入肉樣中心,實時監(jiān)控肉樣中心溫度。③將肉樣置于功率為1 500 W、水溫為80℃的恒溫數(shù)顯水浴鍋中加熱。待肉樣中心溫度達到70℃時,將肉樣從水浴鍋中取出,冷卻至中心溫度為0～4℃。④拔出熱電偶測溫儀,為保證取出的肉樣直徑相同,統(tǒng)一用直徑為1.5 cm的圓形取樣器沿與肌纖維平行的方向鉆取肉樣,取樣位置距離樣品邊緣不少于5 mm,兩個取樣邊緣間距不少于5 mm,剔除有明顯缺陷的孔樣,每個樣本選取6個孔樣進行測量。⑤嫩度測定。將樣本放置于質(zhì)構(gòu)儀的刀槽中央,使肌纖維方向與刀口上下移動的方向垂直,啟動肉塊剪切程序,設置刀具下行速度為60 mm/min,初始力為0.1 N,下行距離為25 mm,探頭返回速度為200 mm/min,測得的最大剪切力(峰值),即為孔樣的剪切力測定值。分別測得同一樣本6個孔樣的最大剪切力,取平均值作為該肉樣的剪切力。

1.4 肌纖維顯微圖片的采集

1.4.1制樣

將肉品置于常溫下解凍,沿著肌纖維方向取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉塊作為樣品,樣品放入液氮中凍結(jié)后裝入凍存管中保存并標號,每塊肉取3個樣品。

1.4.2切片

切片具體步驟為：①打開冷凍切片機,保持冷凍切片機的溫度不變。取出組織支承器,將樣品的一面貼于組織支承器上,放平擺好樣品,周邊滴上水,速放于冷凍臺上。待水冷凍凝固后樣品便固定在組織支承器上。②將固定在組織支承器上樣品連同組織支承器夾緊于切片機持承器上,啟動粗進退鍵,慢慢轉(zhuǎn)動旋鈕,控制刀片進退,將樣品表面修平。③調(diào)好要切的厚度,一般在5～10 μm之間。本試驗中將厚度調(diào)整為8 μm。④蓋上并調(diào)整好防卷板,制作牛肉組織的切片。切片時,切出的切片要求能迅速地并且順利地通過刀片與防卷板間的通道,并且能夠平整地沒有卷翹地放置在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板,取一載玻片,將其切片貼于載玻片上,并貼上編號,每個樣品取3個切片。

1.4.3H- E染色

染色之前用蒸餾水潤濕已脫蠟并已梯度入水的組織1～2 min,甩掉水分,確保蒸餾水潤濕整個組織,并均勻分布;核染液(紫紅色液體)染色5 min左右,水洗3～5 s;漿染液(紅色液體)染色10～30 s,用增色液沖洗1～2 s,濾紙吸干。

1.4.4圖像采集

將染色后的載玻片在顯微鏡20倍物鏡下觀察并拍照,同一個載玻片拍3幅圖像。

1.5 肌纖維相關(guān)參數(shù)的測量

1.5.1圖像處理

由于制片、切片、染色、拍攝過程中不可避免地出現(xiàn)一些誤差,所以在進行肌纖維相關(guān)參數(shù)的測量前,使用Image- Pro Plus軟件對肌纖維的顯微圖片進行預處理。

首先,經(jīng)染色后,肌纖維顏色與背景顏色有較大的差異,為此,利用Image- Pro Plus軟件的選色工具將肌纖維從背景中分割出來;其次,在進行特征參數(shù)測量時,二值化圖像能更加方便測量,而且便于利用Filter工具對圖像的形狀進行修飾處理。因此,對選色分割后的圖像進行二值化處理;牛肉的顯微圖像在經(jīng)過上述處理后,還存在一定的噪聲,此外,許多纖維之間還存在著細小的粘連,若直接進行特征參數(shù)測量會導致較大誤差。為此,先使用Filter工具對圖片進行降噪,然后利用close工具,對圖像進行腐蝕和膨脹,去除圖像中的大尺度噪聲,并消除纖維之間存在的細小的粘連;圖像修飾完成后,利用軟件的計數(shù)工具對需要測量的部分進行計數(shù),每個待測量紅色區(qū)域稱為一個感興趣區(qū)域,預處理過程與結(jié)果如圖1所示。

圖1 顯微圖像預處理Fig.1 Preprocessing of micrographs

1.5.2肌纖維直徑的測量

使用Image- Pro Plus的測量工具對肌纖維的相關(guān)特性進行測量。

肌纖維直徑的測量方法如下:

由顯微圖可知,肌纖維截面多呈現(xiàn)非規(guī)則的多邊形或圓形,如圖2所示。為此,需首先找出每個肌纖維區(qū)域的圖形中心,然后從該中心出發(fā),每隔2°向區(qū)域兩端繪制線段,測量出每個線段的長度,取這些線段長度的平均值作為該肌纖維的直徑。

圖2 肌纖維直徑測量原理圖Fig.2 Principle diagram of muscle fiber diameter measuring

1.5.3肌纖維周長的測量

肌纖維周長是指每一個肌纖維的輪廓長度,如圖3所示?？梢院唵瓮ㄟ^Image- Pro Plus軟件統(tǒng)計計算出邊界點的像素點個數(shù),得到一個肌纖維的周長。

圖3 肌纖維周長測量原理圖Fig.3 Principle diagram of muscle fiber perimeter measuring

1.5.4肌纖維密度的測量

肌纖維密度是指單位面積內(nèi)肌纖維的根數(shù),計算公式為

(1)

式中Di——肌纖維密度

Ni——視野中完整肌纖維的根數(shù)

Ai——顯微鏡視野面積

由于本文中顯微鏡的視野面積相同,因此下文使用視野內(nèi)肌纖維的根數(shù)表示肌纖維的密度(單位：根)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同牛齡牛肉肌纖維直徑的變化及其與剪切力的關(guān)系

牛肉肌纖維直徑隨著牛齡的變化而變化。為評估牛齡對肌纖維直徑的影響,對不同牛齡牛肉肌纖維直徑進行統(tǒng)計分析和方差計算,結(jié)果如表1所示。隨著牛齡的增加,肌纖維直徑呈遞增趨勢[24]。

表1 不同牛齡牛肉肌纖維直徑統(tǒng)計及方差分析Tab.1 Muscle fiber diameter values and varianceanalysis of different physiological ages μm

注:同列中不同上標字母表示肌纖維組間對比存在顯著性差異(P<0.05),下同。

從方差分析可知,18個月牛齡牛肉的肌纖維直徑與54個月和72個月的有顯著差異，36個月牛齡牛肉的肌纖維直徑僅與72個月的有顯著差異，54個月牛齡的牛肉肌纖維直徑與18個月和72個月的有顯著差異,72個月牛齡的牛肉肌纖維直徑與其它3個月齡牛肉均有顯著差異。這可能是因為在18個月到36個月之間以及36個月到54個月之間,牛肉肌纖維直徑增長相對較緩慢,因此盡管直徑有變化,但變化不明顯。54個月之后到72個月之間,肌纖維直徑增長相對較快,因此,與其它月齡之間的差異變得明顯。

用線性模型對牛齡與肌纖維直徑之間的變化關(guān)系進行回歸分析并進行顯著性檢驗,結(jié)果表明,牛齡與肌纖維直徑之間存在顯著的線性關(guān)系(P<0.05),可描述為

y1=39.07+0.20x

(2)

式中y1——肌纖維直徑，mmx——牛齡

若做出肌纖維直徑與剪切力的散點圖,結(jié)果如圖4所示,顯然,肌纖維直徑與剪切力存在近似的線性關(guān)系。相關(guān)性分析顯示,肌纖維直徑與剪切力的相關(guān)系數(shù)為0.798,極其顯著(P<0.01),說明隨著肌纖維直徑的增大,牛肉剪切力將線性增加。這與諶啟亮等[25]在牛肉嫩度相關(guān)的研究中同樣利用冷凍切片染色以及觀察顯微圖像的方法得出的結(jié)論一致。劉正柱等[26]也在影響牛肉品質(zhì)的因素及牛肉嫩度的改善方法研究中提出,家畜體型越大肌纖維越粗大,肉嫩度越低。趙改名等[27]也在研究中得出同樣的結(jié)論。

圖4 肌纖維直徑與剪切力散點圖Fig.4 Scatter plot of muscle fiber diameter and shear stress

2.2 不同牛齡牛肉肌纖維周長的變化及其與剪切力的關(guān)系

為評估牛齡對肌纖維周長的影響,對不同牛齡牛肉肌纖維周長進行統(tǒng)計分析和方差計算,結(jié)果如表2所示。隨著牛齡的增加,肌纖維周長也呈遞增趨勢。

表2 不同牛齡牛肉肌纖維周長統(tǒng)計及方差分析Tab.2 Muscle fiber perimeter values and varianceanalysis of different physiological ages μm

從方差分析可知,18個月與36個月、54個月、72個月牛齡的牛肉肌纖維周長差異性均很顯著,且牛齡差距越大,顯著性越高。36個月與54個月的牛肉肌纖維周長的差異性不顯著,與72個月的牛肉肌纖維差異性顯著。54個月與72個月的牛肉肌纖維差異性也顯著?？赡艿脑蚴?18個月到36個月之間,肉牛生長迅速,因此,肌纖維周長增長相對較快,36個月到54個月及以后,肉牛生長相對較慢,因此肌纖維周長增長也相對較慢。

同樣地,用線性模型對牛齡與肌纖維周長之間的變化關(guān)系進行回歸分析及顯著性檢驗,結(jié)果表明,牛齡與肌纖維周長之間也存在顯著的線性關(guān)系(P<0.05),可表示為

y2=241.6+1.315x

(3)

式中y2——肌纖維周長，μm

若做出肌纖維周長與剪切力的散點圖(圖5),肌纖維直徑與剪切力之間也存在近似的線性關(guān)系。相關(guān)性分析顯示,肌纖維周長與剪切力的線性相關(guān)系數(shù)可達0.788, 顯著性極其顯著(P<0.01),說明隨著肌纖維周長的增大,牛肉剪切力線性增加。

圖5 肌纖維周長與剪切力散點圖Fig.5 Scatter plot of muscle fiber perimeter and shear stress

2.3 不同牛齡牛肉肌纖維密度的變化及其與剪切力的關(guān)系

對不同牛齡牛肉的肌纖維密度做統(tǒng)計分析及組間方差計算,結(jié)果如表3所示。隨著牛齡的增加,肌纖維密度逐漸降低。王衛(wèi)[28]的研究中也表明,伴隨著牛生長過程中肌纖維體積的增大變粗以及脂肪含量與結(jié)締組織隨之增多,肌纖維的密度會相對減小。18個月與36個月的牛肉肌纖維密度差異性不顯著,18個月與54個月和72個月的牛肉肌纖維密度差異性顯著,且牛齡差距越大,差異性越顯著,36個月的牛肉肌纖維僅與72個月的差異性顯著。這表明,各牛齡之間的肌纖維密度的變化相對不明顯。

表3 不同牛齡肌纖維密度統(tǒng)計及方差分析Tab.3 Muscle fiber density values and varianceanalysis of different physiological ages 根

線性回歸分析及顯著性檢驗表明,牛齡與肌纖維密度之間存在顯著的線性關(guān)系(P<0.05),可表示為

y3=119.2-0.381x

(4)

式中y3——肌纖維密度，根

圖6表示了肌纖維密度與剪切力關(guān)系,顯然,隨著肌纖維密度的增大,牛肉剪切力呈下降趨勢,二者之間存在近似的線性關(guān)系。進一步的相關(guān)性分析顯示,肌纖維密度與剪切力的線性相關(guān)性極其顯著(P<0.01),因此,隨著肌纖維密度的增大,牛肉剪切力線性降低。王衛(wèi)[28]在牛肉嫩度智能預測方法研究中也提出,肌纖維密度越密,肌纖維越細,肉質(zhì)越細嫩,這與試驗結(jié)論一致。羿慶燕等[29]在研究不同質(zhì)量等級延邊黃牛肉肌纖維的組織特性中也得出同樣結(jié)論。

圖6 肌纖維密度與剪切力散點圖Fig.6 Scatter plot of muscle fiber density and shear stress

上述的試驗研究表明,隨著牛齡的增大,即隨著肉牛生理成熟度的增加,構(gòu)成牛肉的基本組織——肌纖維的微觀結(jié)構(gòu)會發(fā)生顯著的變化,這種變化將導致牛肉剪切力隨之改變,從而對牛肉的重要品質(zhì)參數(shù)之一——嫩度產(chǎn)生顯著的影響。牛齡與肌纖維微觀參數(shù)之間、肌纖維微觀參數(shù)與剪切力之間存在明確的線性關(guān)系,因此,可以通過對肌纖維微觀參數(shù)的測定乃至根據(jù)牛肉的剪切力,實現(xiàn)對牛肉生理成熟度的預測和判定。

3 結(jié)論

(1)牛齡對牛肉肌纖維直徑有顯著的影響,隨著牛齡的增大,牛肉肌纖維直徑線性增加;而隨著肌纖維直徑的增加,牛肉剪切力將線性增大。

(2)牛齡顯著影響牛肉肌纖維周長,隨著牛齡的增大,牛肉肌纖維周長線性增加;牛肉肌纖維周長的增加,將導致牛肉剪切力線性增大。

(3)牛肉肌纖維密度受牛齡的影響顯著,隨著牛齡的增大,牛肉肌纖維密度將逐步下降;隨肌纖維密度的下降,牛肉剪切力線性增加。

(4)牛齡、牛肉肌纖維微觀參數(shù)及牛肉剪切力之間存在顯著的相關(guān)性,它們之間的關(guān)系,可以用明確的線性模型進行描述。

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