劉金泉 李 明 胡 云 李發(fā)虎 張清梅 王雪玉

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 包頭 014109)

0 引言

我國(guó)2016年蔬菜生產(chǎn)規(guī)模、產(chǎn)量和出口規(guī)模均居世界第一，其中設(shè)施蔬菜播種面積4 973.10 khm2、產(chǎn)量2.62億t，預(yù)計(jì)今后幾年蔬菜產(chǎn)業(yè)規(guī)模仍將保持小幅增長(zhǎng)勢(shì)頭[1]。但是，目前我國(guó)設(shè)施蔬菜生產(chǎn)過程中由于連作、簡(jiǎn)單輪作、肥料過分投入等原因造成土壤理化性狀惡化、微生物區(qū)系失衡、植物源有害物累積等問題，普遍引起了土壤質(zhì)量退化和作物產(chǎn)量下降，如何阻控土壤功能衰退并恢復(fù)土壤健康，實(shí)現(xiàn)設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，是設(shè)施蔬菜生產(chǎn)亟待解決的問題[2-3]。20世紀(jì)80年代以來，隨著化肥工業(yè)的迅猛發(fā)展，綠肥生產(chǎn)和應(yīng)用日益減少，在目前我國(guó)農(nóng)業(yè)“減肥增效、土壤有機(jī)質(zhì)提升、綠色安全生產(chǎn)”等的需求背景下，利用綠肥改良設(shè)施土壤成為一種重要途徑。研究表明：綠肥可為農(nóng)田提供肥源、減少化肥施用，并可合理用地養(yǎng)地、提供飼草來源、改善生態(tài)環(huán)境、節(jié)能減耗等[4]；綠肥翻壓還田不僅改善土壤的通透性、提高土壤中養(yǎng)分質(zhì)量比和土壤酶活性，而且可以增加土壤微生物數(shù)量、調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)、減少和抑制土傳病害發(fā)生[5-6]。

目前，雖然綠肥影響土壤菌群、養(yǎng)分和作物生長(zhǎng)方面的研究較多，但多為大田試驗(yàn)，并且對(duì)于影響根際菌群結(jié)構(gòu)的研究偏少，在北方設(shè)施條件下利用高粱作為綠肥改良設(shè)施土壤菌群結(jié)構(gòu)和黃瓜生長(zhǎng)方面研究鮮見報(bào)道。本文針對(duì)北方設(shè)施土壤菌群退化現(xiàn)狀，通過在黃瓜定植前種植不同密度高粱作綠肥處理，研究其影響黃瓜生長(zhǎng)、根際土壤養(yǎng)分和菌群變化規(guī)律和內(nèi)在機(jī)制，以期為綠肥在設(shè)施生產(chǎn)應(yīng)用上提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年3—7月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝基地進(jìn)行，試驗(yàn)用日光溫室南北跨度7 m，東西長(zhǎng)52 m，黃瓜品種為“津春改良2號(hào)”。土壤性質(zhì)為沙壤土，有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀質(zhì)量比分別為41.16、1.31、1.37、12.48 g/kg，容重1.28 g/cm3，電導(dǎo)率106.82 μS/cm。

1.2 試驗(yàn)方法

采用田間試驗(yàn)法，以正常定植土壤設(shè)為CK(對(duì)照)，設(shè)A1、A2、A3 3種處理，分別為在黃瓜定植前40 d播撒240、120、60 kg/hm2高粱種子，在黃瓜定植前將長(zhǎng)出的高粱植株翻入土壤中作為綠肥。黃瓜苗4月10日定植，種植密度42 000株/hm2，每處理小區(qū)面積14 m2，重復(fù)3次，各處理生長(zhǎng)期管理措施一致。在黃瓜結(jié)果盛期(6月15日)測(cè)定植株根系數(shù)、根總體積、根冠比、莖粗、總?cè)~面積、單株結(jié)瓜數(shù)和總產(chǎn)量；每種處理均用抖落法分別取6處樣地根際0～20 cm處土壤，均勻混合測(cè)定細(xì)菌群落；用抖落法取根際0～20 cm處土壤，測(cè)定有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀質(zhì)量比以及過氧化氫酶、脲酶活性，每處理重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定方法

根系數(shù)為統(tǒng)計(jì)超過0.5 cm長(zhǎng)的黃瓜植株一級(jí)和二級(jí)側(cè)根總和；根體積通過將根系平鋪于Epson Perfv700型掃描儀進(jìn)行掃描，并用WinRHIZO Pro 2009a軟件分析測(cè)得；根冠比通過植株地下部和地上部干質(zhì)量比值計(jì)算；莖粗用游標(biāo)卡尺測(cè)定；葉片總面積用葉面積掃描儀測(cè)定；產(chǎn)量用千分之一天平測(cè)定。土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀質(zhì)量比分別用重鉻酸鉀外加熱法、堿解- 擴(kuò)散法、碳酸氫鈉浸提- 鉬銻抗比色法和乙酸銨浸提- 火焰光度計(jì)法測(cè)定，過氧化氫酶活性測(cè)定用高錳酸鉀滴定法，脲酶活性用奈氏比色法。細(xì)菌物種用16SrDNA高通量測(cè)序法測(cè)定，采用雙可變區(qū)鑒定菌種，使用高可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物建庫，文庫構(gòu)建遵循Illumina測(cè)序儀文庫構(gòu)建方法，以V3、V4為目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使用DNA模板50 ng、25 μL的PCR體系，使用Phusion酶擴(kuò)增25～35個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物使用Beads純化，之后將構(gòu)建好的文庫上樣到cBots或簇生成系統(tǒng)，用于簇生成和MiSeq測(cè)序，對(duì)測(cè)序獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行樣品區(qū)分、拼接、過濾及Q20、Q30等質(zhì)控分析，對(duì)最終獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行OUT聚類分析和物種分類學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007 整理，處理間生長(zhǎng)指標(biāo)差異用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯著性水平為0.05，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表達(dá)，用SPSS 19.0 軟件做數(shù)據(jù)間Pearson相關(guān)分析；用RDP、GREENGENE和NCBI數(shù)據(jù)庫資源做細(xì)菌物種分類分析，并用R語言繪制物種熱圖，在不同分類水平上列出比例最大的前20種優(yōu)勢(shì)菌群，通過不同顏色和長(zhǎng)度反映各處理細(xì)菌群落組成的差異性和比例，基于各處理的OUT組成分析結(jié)果，用EUCLIDEAN、UNWEIGHTED UNIFRAC、WEIGHTED UNIFRAC 3種不同算法計(jì)算樣品間距離矩陣，用UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)方法對(duì)樣品進(jìn)行豐度相似性聚類，將聚類結(jié)果表示在熱圖上。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)黃瓜根際土壤養(yǎng)分指標(biāo)的影響

由表1可見，在黃瓜結(jié)果期，與對(duì)照相比，A1、A2、A3處理分別顯著提高有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比31.66%、15.55%、10.61%，分別顯著提高堿解氮質(zhì)量比8.75%、5.35%、3.13%，分別顯著提高速效磷質(zhì)量比13.89%、16.86%、20.65%，分別顯著提高速效鉀質(zhì)量比16.86%、16.45%、21.07%；與對(duì)照相比，過氧化氫酶活性各處理差異不顯著，脲酶活性A1處理顯著提高6.85%，而A2和A3處理差異不顯著。

2.2 不同處理對(duì)黃瓜結(jié)果期生長(zhǎng)指標(biāo)和產(chǎn)量的影響

由表2可見，在黃瓜結(jié)果期，與對(duì)照相比，根冠比各處理與對(duì)照差異不顯著，根系數(shù)、葉片總面積A1、A2處理均顯著高于對(duì)照，而A3處理與對(duì)照差異不顯著。對(duì)于莖粗、根總體積、單株結(jié)瓜數(shù)和總產(chǎn)量，A1處理均顯著高出對(duì)照，而A2、A3處理均與對(duì)照差異不顯著。綜合來看，A1處理效果最為顯著，而A2、A3則與對(duì)照差異不顯著。與對(duì)照相比，A1處理可顯著提高結(jié)果期黃瓜莖粗12.83%、根系數(shù)15.81%、根總體積24.11%、葉片總面積11.43%、單株結(jié)瓜數(shù)10.97%、總產(chǎn)量9.81%；并且與對(duì)照相比，A1處理每公頃可提高黃瓜產(chǎn)量15.95t，而僅需投入240 kg的高粱種子，塑料膜、工具等生產(chǎn)資料不需額外投資，人工只需種植，日常幾乎不需要管理，經(jīng)濟(jì)上可行，同時(shí)設(shè)施土壤質(zhì)量得到提升。

表1 不同處理對(duì)黃瓜根際土壤養(yǎng)分指標(biāo)的影響Tab.1 Effects of different treatments on nutrient index of rhizosphere soil of cucumber

注：表中同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

表2 不同處理對(duì)黃瓜結(jié)果期生長(zhǎng)指標(biāo)和產(chǎn)量的影響Tab.2 Effects of different treatments on cucumber growth index and yield in fruiting period

2.3 不同處理對(duì)黃瓜根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可見，在門分類水平上，對(duì)照和A3處理歸為一類，A2處理與上述二者有所差別，而A1處理與上述三者類別差異最大；構(gòu)成黃瓜根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)，占到各樣品土壤細(xì)菌群落比例91.12%～93.59%；與對(duì)照相比，各處理可明顯提高放線菌門、厚壁菌門比例而降低擬桿菌門比例。與對(duì)照相比，A1處理可明顯提高變形菌門比例13.84%、放線菌門比例22.83%、厚壁菌門比例17.26%，降低酸桿菌門比例18.49%、綠彎菌門比例18.69%、擬桿菌門比例22.90%。

圖1 門分類水平上各處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)圖和物種熱圖Fig.1 Structure diagram and heat map of bacterial community at level of classification of phylum

圖2 科分類水平上各處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)圖和物種熱圖Fig.2 Structure diagram and heat map of bacterial community at level of classification of family

由圖2可見，在科分類水平上，對(duì)照和A2處理歸為一類，A3處理與上述二者有所差別，而A1處理與上述三者類別差異最大；構(gòu)成黃瓜根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)為Gp6科、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、黃色單胞菌科(Xanthomonadaceae)、Gp16科、Gp4科、紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、中華桿菌科(Sinobacteraceae)、生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)，占到各樣品土壤細(xì)菌群落比例27.22%～29.50%。各處理可明顯提高紅螺菌科比例。與對(duì)照相比，A1處理可明顯提高鞘脂單胞菌科比例12.27%、黃色單胞菌科比例16.41%、紅螺菌科比例82.35%、中華桿菌科比例23.81%、生絲微菌科比例19.20%，降低Gp6科比例20.10%、Gp16科比例13.33%、Gp4科比例43.21%。

2.4 不同處理下黃瓜生長(zhǎng)指標(biāo)和根際土壤細(xì)菌菌落比例相關(guān)性分析

由表3可見，在門分類水平上，酸桿菌門比例與莖粗、葉片總面積、總產(chǎn)量均顯著負(fù)相關(guān)，綠彎菌門比例與脲酶活性顯著負(fù)相關(guān)，厚壁菌門比例與速效磷質(zhì)量比顯著正相關(guān)；在科分類水平上，Gp16科與過氧化氫酶活性顯著負(fù)相關(guān)，鞘脂單胞菌科比例與脲酶活性顯著正相關(guān)，黃色單胞菌科比例與根總體積顯著正相關(guān)，紅螺菌科比例與根系數(shù)、葉片總面積、堿解氮質(zhì)量比顯著正相關(guān)，中華桿菌科比例與脲酶活性顯著正相關(guān)。

3 討論

趙秋等[7]發(fā)現(xiàn)二月蘭、冬油菜、草木樨3種華北綠肥對(duì)生菜增產(chǎn)效果顯著，利于促進(jìn)生菜根系發(fā)育，促進(jìn)葉片可溶性糖、蛋白質(zhì)和維生素C含量積累。馮海萍等[8]研究表明：高丹草翻壓量為3.75 t/hm2并配施80%比例化肥可降低設(shè)施土壤pH值、顯著提高土壤全氮、堿解氮和速效磷質(zhì)量比，顯著增加芹菜產(chǎn)量、土壤總菌數(shù)、細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，減少真菌數(shù)量和比例，處理效果較好。本試驗(yàn)中利用高粱綠肥可提高土壤養(yǎng)分含量并促進(jìn)設(shè)施黃瓜生長(zhǎng)，與前人研究一致，但高粱綠肥種植密度60～120 kg/hm2時(shí)對(duì)黃瓜生長(zhǎng)和產(chǎn)量作用并不明顯，而種植密度為240 kg/hm2時(shí)促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)效果明顯，莖粗、根系數(shù)、根總體積、葉片總面積、單株結(jié)瓜數(shù)、總產(chǎn)量指標(biāo)以及土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀質(zhì)量比、脲酶活性均顯著提高。

表3 黃瓜生長(zhǎng)指標(biāo)、土壤養(yǎng)分指標(biāo)與細(xì)菌群落比例相關(guān)系數(shù)Tab.3 Correlation coefficient between cucumber growth and soil nutrient index with bacterial community ratio

注：*表示在0.05水平上顯著相關(guān)。

白小軍等[9]發(fā)現(xiàn)甜玉米、高丹草、蘇丹草3種綠肥可在溫室夏季休閑季節(jié)產(chǎn)生較高生物量和養(yǎng)分積累量，降低土壤pH 值，提高土壤速效養(yǎng)分質(zhì)量比，增加總菌數(shù)、細(xì)菌和放線菌數(shù)量，減少真菌數(shù)量和比例，改善土壤微生態(tài)環(huán)境。趙秋等[10]研究表明：毛苕子與二月蘭冬綠肥可提高華北玉米土壤有機(jī)碳質(zhì)量比4.5%～5.7%，顯著提高細(xì)菌數(shù)量2.0～3.7倍。張黎明等[11]的試驗(yàn)表明：綠肥翻壓處理后，細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量分別提高36.29%、82.88%和9.16%，禾本科綠肥對(duì)土壤微生物量影響最大，其次是豆科綠肥，十字花科綠肥影響較小。本試驗(yàn)表明240 kg/hm2種植密度的高粱綠肥可明顯改變黃瓜根際土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，在門分類水平上可明顯提高變形菌門、放線菌門、厚壁菌門比例而降低酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門比例，科分類水平上可明顯提高鞘脂單胞菌科、黃色單胞菌科、紅螺菌科、中華桿菌科、生絲微菌科比例而降低Gp6科、Gp16科、Gp4科比例，上述研究結(jié)果在一定程度上補(bǔ)充和豐富了前人的研究。

根際微環(huán)境內(nèi)微生物可不斷從土壤和根系中得到碳源和養(yǎng)料，導(dǎo)致其特定微生物數(shù)量和種群分布高于根際外，且顯著差異[12-13]。同時(shí)，植物還可將光合同化產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至根際內(nèi)形成根際沉淀物，促進(jìn)土壤微生物生長(zhǎng)、代謝和富集[14]，馬曉梅等[15]認(rèn)為根際微生物種群數(shù)量和分布與植物光合有一定關(guān)系，春季林木光合固碳量增多，根際微生物數(shù)量明顯高于非根際，而秋季林木根系轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)物減少，根際微生物數(shù)量顯著降低。此外，根際微生物可參與根際微環(huán)境物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)過程，從而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性和養(yǎng)分的高效利用[16]。一些研究表明：微生物不僅是土壤有機(jī)質(zhì)形成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的重要?jiǎng)恿?，而且影響和調(diào)控養(yǎng)分供給狀態(tài)，反之，土壤養(yǎng)分狀況也深刻影響微生物種類和數(shù)量，二者間存在緊密關(guān)系[17-20]，變形菌門比例增多和酸桿菌門比例的減少可提高黃瓜根際土壤速效養(yǎng)分含量[21]。FIERER等[22]研究表明：變形菌門相對(duì)豐度隨土壤施氮量增加而上升，而酸桿菌卻表現(xiàn)出相反趨勢(shì)。黃色單胞菌能夠在植物根際土壤中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，該酶是纖維素分解酶系中的重要組分，參與降解纖維素生成葡萄糖過程[23], 紅螺菌具有固氮能力并可提高土壤肥力使作物增產(chǎn)，改善土壤環(huán)境，利于根系發(fā)育，紅螺菌代謝分泌物中含大量氨基酸和有機(jī)酸，可刺激植物根系對(duì)鐵的吸收,促進(jìn)作物生長(zhǎng)[24]。試驗(yàn)相關(guān)性分析表明：在設(shè)施黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育過程中，根際土壤中酸桿菌門抑制黃瓜莖粗和葉片生長(zhǎng)進(jìn)而抑制產(chǎn)量的提高，綠彎菌門可抑制土壤脲酶活性，Gp16科抑制過氧化氫酶活性；同時(shí)，根際土壤中厚壁菌門可提高速效磷質(zhì)量比，鞘脂單胞菌科提高脲酶活性，黃色單胞菌科可促進(jìn)黃瓜根總體積增長(zhǎng)，紅螺菌科促進(jìn)黃瓜根系數(shù)、葉片總面積及堿解氮含量的提高，中華桿菌科可提高脲酶活性。進(jìn)一步分析表明：240 kg/hm2種植密度的高粱綠肥主要通過降低根際土壤綠彎菌門和提高鞘脂單胞菌科、中華桿菌科比例而提高脲酶活性，通過降低根際土壤酸桿菌門和提高厚壁菌門、黃色單胞菌科、紅螺菌科比例而促進(jìn)堿解氮質(zhì)量比、速效磷質(zhì)量比、莖粗、葉片總面積、根系數(shù)、根總體積的提高，最終促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)和產(chǎn)量的提高。

4 結(jié)論

(1)在寒旱區(qū)日光溫室早春黃瓜定植前種植高粱綠肥密度240 kg/hm2時(shí)，可顯著提高黃瓜根際土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比31.66%、堿解氮質(zhì)量比8.75%、速效磷質(zhì)量比13.89%、速效鉀質(zhì)量比16.86%、脲酶活性6.85%，同時(shí)可顯著提高結(jié)果期黃瓜莖粗12.83%、根系數(shù)15.81%、根總體積24.11%、葉片總面積11.43%、單株結(jié)瓜數(shù)10.97%、總產(chǎn)量9.81%，土壤質(zhì)量得到提升。

(2)240 kg/hm2高粱綠肥處理可明顯提高黃瓜根際土壤中變形菌門、放線菌門、厚壁菌門比例而降低酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門比例，明顯提高鞘脂單胞菌科、黃色單胞菌科、紅螺菌科、中華桿菌科、生絲微菌科比例而降低Gp6科、Gp16科、Gp4科比例；該處理主要通過降低根際土壤綠彎菌門和提高鞘脂單胞菌科、中華桿菌科比例而提高脲酶活性，通過提高厚壁菌門、黃色單胞菌科、紅螺菌科和降低根際土壤酸桿菌門比例而促進(jìn)堿解氮質(zhì)量比、速效磷質(zhì)量比、莖粗、葉片總面積、根系數(shù)、根總體積的提高，最終促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)并提高產(chǎn)量。

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