張冬冬，王紅寧

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川省動(dòng)物疫病預(yù)防與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“985工程”西南資源環(huán)境與災(zāi)害防治科技創(chuàng)新平臺(tái)，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064）

禽致病性大腸桿菌是規(guī)?；u場(chǎng)中最常見的病原菌之一，大多數(shù)易引起感染性疾病如大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫（Hjarre氏病）、腹膜炎、氣囊?。院粑啦?，CRD）、腫頭綜合癥、輸卵管炎、滑膜炎、卵黃囊感染等，最終導(dǎo)致家禽死亡[1]。規(guī)模化雞場(chǎng)中，β-內(nèi)酰胺類抗生素是治療腸桿菌引起的感染性疾病的主要藥物，由于長(zhǎng)期的不規(guī)范用藥，造成了大量耐藥菌的形成。其中，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）是近年來最常見的可以為大腸桿菌提供多種β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的一類水解酶，分為CTX-M、SHV和TEM等多種變異型。近年來，產(chǎn)CTXM型ESBLs的細(xì)菌不僅在畜禽中大量分離出來，在人醫(yī)臨床上造成的耐藥性問題也十分突出[2]。blaCTX-M基因通常由質(zhì)粒攜帶，因此blaCTX-M基因很容易隨著耐藥質(zhì)粒的移動(dòng)在種內(nèi)甚至是不同種屬細(xì)菌間廣泛散播，即耐藥性的水平傳播。

本研究對(duì)29株從四川省規(guī)?；u場(chǎng)中分離到的產(chǎn)CTX-M型ESBLs的大腸桿菌進(jìn)行了接合試驗(yàn)，并對(duì)接合子進(jìn)行耐藥表型和基因型檢測(cè)，探究產(chǎn)ESBLs雞源大腸桿菌中耐藥基因blaCTX-M的水平轉(zhuǎn)移情況，為臨床預(yù)防ESBLs的傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 29株產(chǎn)ESBLs雞源大腸桿菌，從四川省內(nèi)5個(gè)規(guī)?；u場(chǎng)中分離篩選得出；耐利福平的受體菌是大腸桿菌C600，為復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)學(xué)院王明貴教授惠贈(zèng)，對(duì)其他藥物敏感。

1.2 主要試劑 OXOID藥敏紙片，LB液體培養(yǎng)基，MH 瓊脂，2×Taq Plus PCR MasterMix，GoldView 染料，瓊脂糖，DNA Marker 2000 plus，孔徑 0.22μm 濾膜，利福平，頭孢噻肟干粉。

1.3 產(chǎn)ESBLs雞源大腸桿菌中blaCTX-M基因的檢測(cè) 采用煮沸法提取大腸桿菌DNA為模板，按參考文獻(xiàn)[3]中blaCTX-M基因檢測(cè)引物序列（blaCTX-M-1group：F-GGTTAAAAAATCACTGCGTC，R-TTGGTGACGAT TTTAGCCGC；blaCTX-M-9group：F-ATGGTGACAAAGA GAGTGCA，R-CCCTTCGGCGATGATTCTC；blaCTX-M-2group：F-ATGATGACTCAGAGCATTCG，R-TGGGTT ACGATTTTCGCCGC）合成引物，PCR反應(yīng)體系為25μL：2×Taq Plus PCR MasterMix12.5μL，模板 2μL，去離子水 8.5μL，引物 F、R（10μM）各 1μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃、4min；95℃、30s，55～56℃、30 s，72℃、1min，32次循環(huán)；72℃延伸 10min；12℃保存。取5μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將陽性PCR產(chǎn)物送成都擎科公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用NCBI的Blast搜索軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)分析，以確定blaCTX-M的基因亞型。

1.4 接合試驗(yàn) 首先，將29株供體菌接種在含利福平（400μg/mL）的TSA平板上，檢測(cè)供體菌的利福平抗性。若供體菌有利福平抗性，則不能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)。參考濾膜接合法[4]進(jìn)行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)：將篩選出的供體菌和受體菌分別在含頭孢噻肟（4μg/mL）和利福平（400μg/mL）的TSA平板上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)過夜；次日挑取供體菌及受體菌的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4.5h后，分別用生理鹽水稀釋1000倍，取50μL受體菌與50μL供體菌于1.5mL離心管中混合；取混合物置于TSA平板內(nèi)的0.22μm濾膜中央，37℃孵育15h；將濾膜移至5mL無菌離心管中，加入2mL生理鹽水，使用振蕩器清洗膜上的細(xì)菌；取100μL菌懸液涂雙抗（頭孢噻肟4μg/mL和疊氮鈉400μg/mL）TSA平板，同時(shí)稀釋1000倍涂無抗TSA平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日計(jì)算菌株接合效率。接合效率=（接合子數(shù)目×103）/（0.5×無抗平板菌落數(shù)目×106）。

挑取雙抗平板上的接合子單菌落，接種于含雙抗的LB液體培養(yǎng)基中（含頭孢噻肟2μg/mL和疊氮鈉200μg/mL），37℃ 180r/min培養(yǎng)過夜，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 供體菌和接合子的耐藥表型及blaCTX-M基因型比較 根據(jù)CLSI 2013年的標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)供體菌和接合子進(jìn)行10種抗菌藥的耐藥表型檢測(cè)，分別為：頭孢噻肟（CTX）、阿莫西林-棒酸（AMC）、頭孢他啶（CAZ）、阿米卡星（AK）、慶大霉素（CN）、多粘菌素 B（PB）、復(fù)方新諾明（SXT）、環(huán)丙沙星（CIP）、多西環(huán)素（DO）、氟苯尼考（FFC）。接合子blaCTX-M基因的檢測(cè)方法同1.3。

2 結(jié)果與分析

表1 29株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中blaCTX-M基因亞型

2.1 產(chǎn)ESBLs雞源大腸桿菌中blaCTX-M基因的檢測(cè) 使用超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因（blaCTX-M-1群、blaCTX-M-9群、blaCTX-M-2群）引物對(duì)29株產(chǎn)ESBLs雞源大腸桿菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（見表1）顯示：29株大腸桿菌中，CTX-M型ESBLs的檢出率為100%；經(jīng)測(cè)序比對(duì)，29株菌中共檢測(cè)出7種CTX-M基因亞型，其中blaCTX-M-65亞型的數(shù)量最多（8個(gè)），分離率為27.6%；其次為 blaCTX-M-55（7 個(gè)）、blaCTX-M-14（5 個(gè)）、blaCTX-M-79（5個(gè)）、blaCTX-M-27（2個(gè)）、blaCTX-M-15（1個(gè)）、blaCTX-M-123（1個(gè)）。

2.2 blaCTX-M基因陽性雞源大腸桿菌質(zhì)粒的接合試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，受體菌和供體菌在雙抗選擇培養(yǎng)基上均無菌落生長(zhǎng)。29株產(chǎn)ESBLs雞源大腸桿菌與大腸桿菌C600接合，經(jīng)TSA雙抗平板（400 μg/mL利福平和4μg/mL頭孢噻肟）篩選，共獲得11株接合子，接合轉(zhuǎn)移發(fā)生率為37.9%（11/29）；29株菌的接合效率均在10-5～10-3之間（見表2）。

表2 供體菌和接合子的耐藥表型及blaCTX-M基因型比較、接合效率

2.3 供體菌和接合子的耐藥表型及blaCTX-M基因型比較 對(duì)11株接合成功的大腸桿菌進(jìn)行10種抗菌藥物的耐藥表型檢測(cè)，結(jié)果顯示：所有的接合子均對(duì)頭孢噻肟（CTX）有耐藥性，部分接合子對(duì)頭孢他啶（CAZ）、復(fù)方新諾明（SXT）、多西環(huán)素（DO）、氟苯尼考（FFC）中的一種或幾種具有耐藥性；11株接合子中有3株接合子為多重耐藥菌；與供體菌相比，100%接合子的耐藥譜變窄（表2）。

以篩選出的接合子總DNA為模板，對(duì)耐藥基因blaCTX-M進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序比對(duì)，結(jié)果顯示：接合子的CTX-M基因型與相應(yīng)供體菌一致，表明該耐藥基因確實(shí)是通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移水平傳播的。

3 討論

近年來畜牧養(yǎng)殖業(yè)中超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的大量使用已成為普遍現(xiàn)象[5]，食品動(dòng)物源產(chǎn)ESBLs的革蘭氏陰性菌大量增加。目前CTX-M是全球分布最廣泛的ESBL，不僅在人類，而且在動(dòng)物和環(huán)境中都廣泛流行。本研究從四川各地規(guī)?；u場(chǎng)分離到29株產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌，均為blaCTX-M基因陽性，絕大部分屬于4種基因亞型：blaCTX-M-65型、blaCTX-M-55型、blaCTX-M-14型和 blaCTX-M-79型。

接合轉(zhuǎn)移是DNA水平傳播的最主要的機(jī)制之一，在耐藥基因的傳播中具有重要作用。本研究中11株雞源大腸桿菌的blaCTX-M耐藥基因可以通過接合水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致耐藥基因傳播，而且接合成功率和接合效率均較高。另外18株菌不能通過接合傳遞，表明這些耐藥基因可能存在于染色體上，也可能存在于某些不能在同種或不同種屬細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上。由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，11株接合子中有3株為多重耐藥菌，對(duì)其他類型抗菌藥也表現(xiàn)出了耐藥性，提示耐這些藥物的基因也隨著含有blaCTX-M的接合性質(zhì)粒而傳遞，這些耐藥基因很可能位于同一質(zhì)粒上。

在規(guī)?；u場(chǎng)，用于治療大腸桿菌引發(fā)呼吸道感染的抗菌藥中，只有氨基糖苷類抗菌藥和β-內(nèi)酰胺類抗菌藥中的頭孢菌素能有效治療。用于治療大腸桿菌感染的抗菌藥種類有限，必然會(huì)對(duì)雞體內(nèi)的大腸桿菌長(zhǎng)期施加相對(duì)單一的抗生素選擇壓力，進(jìn)而導(dǎo)致大腸桿菌分離株中出現(xiàn)大量的抗β-內(nèi)酰胺類藥物的菌株。近幾年產(chǎn)blaCTX-M菌株的分離率逐漸升高，就是由于blaCTX-M可以通過接合在不同菌株間傳播，以及β-內(nèi)酰胺類抗生素的選擇壓力所致。動(dòng)物源耐藥菌的增多，不僅增加了臨床上治療用藥的難度，而且有傳播到人類呼吸道及腸道的潛在威脅。因此，對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的水平傳播進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)于嚴(yán)格規(guī)范抗菌藥使用、減少多重耐藥菌出現(xiàn)具有重要意義。

[1]李永清，甘孟侯.禽大腸桿菌病防制研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，20（4）：414-416.

[2]常洪美.2005～2008年臨床常見細(xì)菌耐藥性分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36（19）：3718-3720.

[3]Eckert C，Gautier V，Saladin-Allard M，et al.Dissemination of CTX-M-type β-lactamases among clinical isolates of Enterobacteriaceae in Paris，F(xiàn)rance[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2004，48（4）：1249-1255.

[4]Clewell D B，An F Y，White B A，et al.Sexpheromones and plasmid transfer in Streptococcus faecalis：apheromone，cAM373，which is also excreted by Staphylococcus aureus[J].Basic Life Sciences，1985，30（5）：489-503.

[5]應(yīng)永飛.濫用獸藥是自毀養(yǎng)殖“長(zhǎng)城”——畜禽產(chǎn)品的獸藥殘留問題及其解決對(duì)策[J].中國(guó)動(dòng)物保健，2008（3）：21-26.