陳 仲，蔣經(jīng)偉，高 杉，孫紅娟，董 穎，周遵春

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus)是我國近海主要的增養(yǎng)殖品種之一[1]。近年來，由細(xì)菌導(dǎo)致的仿刺參病害頻發(fā)，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。開展仿刺參免疫的分子機(jī)制和特性研究，將有助于利用免疫調(diào)控等手段提高仿刺參的免疫力，預(yù)防仿刺參病害發(fā)生[3]。

仿刺參屬于海洋無脊椎動(dòng)物，為開管式循環(huán)系統(tǒng)，主要依靠體腔細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體腔液上清介導(dǎo)的體液免疫抵御病原入侵和環(huán)境脅迫[4-5]。體腔細(xì)胞可表達(dá)多種免疫相關(guān)酶，以不同的方式參與仿刺參對(duì)病原的免疫應(yīng)答。目前已鑒定出仿刺參體腔細(xì)胞中的免疫相關(guān)酶包括：堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等。酸性磷酸酶是仿刺參吞噬細(xì)胞中溶酶體的標(biāo)志酶和巨噬細(xì)胞中的重要水解酶。它可以消化細(xì)胞中由異物顆粒形成的吞噬體[6]，增強(qiáng)對(duì)病原的吞噬作用，達(dá)到抑制或殺死病原菌的目的。堿性磷酸酶在堿性條件下可以水解病原表面的磷酸基團(tuán)，達(dá)到殺死或抑制病原體的效果[7]。酚氧化酶是無脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)中的重要氧化酶，主要通過氧化酚類底物生成醌，再經(jīng)非酶促反應(yīng)生成黑色素[8]，以直接凝集、抑制和殺傷病原，還可以促進(jìn)吞噬、損傷修復(fù)等多種免疫反應(yīng)[9-10]。超氧化物歧化酶是無脊椎動(dòng)物體內(nèi)重要的自由基清除劑，能夠清除機(jī)體吞噬病原體等過程中產(chǎn)生的過量活性氧，免除其對(duì)機(jī)體自身的損傷[11]，同時(shí)還可以催化超氧陰離子，產(chǎn)生具有強(qiáng)殺菌活性的H2O2，直接參與抑菌、殺菌過程[12]。過氧化氫酶是無脊椎動(dòng)物中重要的抗氧化酶，清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基，預(yù)防由活性氧積累而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激[11,13]。

筆者選用分離自仿刺參病參并被鑒定為仿刺參“腐皮綜合征”病原[14]的4株病原菌，通過追蹤不同病原菌刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中多種免疫相關(guān)酶的活力變化，初步揭示仿刺參體腔細(xì)胞的免疫應(yīng)答特點(diǎn)，為了解仿刺參的免疫特性、促進(jìn)仿刺參的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參幼參550只，體質(zhì)量(6.4±1.1) g，來源于遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院引育種中心，鮮活樣品取回后于人工育苗池中常規(guī)條件暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)期間不投餌，水溫16～18 ℃，pH 8.3～8.5，鹽度29。

試驗(yàn)用燦爛弧菌(Vibriosplendidus)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifacien)、希瓦氏菌(Shewanellabaltica)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的菌株信息見表1。上述菌株在150 r/min，28 ℃的條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，4 ℃，9000 r/min離心 15 min，棄上清液，加適量無菌海水重懸，調(diào)整細(xì)菌終密度為107～108cfu/mL，用于仿刺參體腔注射。

表1 試驗(yàn)病原菌株信息

1.2 方法

試驗(yàn)共分為5組，分別為對(duì)照組、燦爛弧菌組、假交替單胞菌組、希瓦氏菌組和蠟樣芽孢桿菌組。對(duì)照組中，用滅菌注射器通過腹部向每只仿刺參的體腔注射100 μL無菌海水，試驗(yàn)組中，每只仿刺參體腔注射100 μL對(duì)應(yīng)的細(xì)菌懸液，注射后仿刺參無明顯病癥。注射后0、4、12、24、48、72 h和96 h取樣，解剖獲得體腔液，4 ℃，3000 r/min 離心15 min，收集體腔細(xì)胞沉淀，用1 mL的磷酸鹽緩沖液重懸，超聲破碎儀破碎(間歇3 s 工作3 s，共10次)，破碎后的體腔細(xì)胞在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，取上清液凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)試驗(yàn)組每次取15只個(gè)體，平均分成3組。

酸性磷酸酶活力的測定按照對(duì)硝基苯基磷酸酯底物法[15]操作。將對(duì)硝基苯基磷酸酯溶于100 mmol/L、pH 4.5 的醋酸鈉—醋酸緩沖液中，制成2 mmol/L 的對(duì)硝基苯基磷酸酯溶液。100 μL樣品加入到對(duì)硝基苯基磷酸酯溶液中混勻，37 ℃ 30 min，再加入 2.9 mL 100 mmol/L的NaOH溶液，測定405 nm 波長下的吸光值。產(chǎn)生1 mg對(duì)硝基苯酚定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

堿性磷酸酶活力測定中，將對(duì)硝基苯基磷酸酯溶于100 mmol/L，pH 9.5的甘氨酸—?dú)溲趸c緩沖液，其他操作及酶活力單位定義同酸性磷酸酶[15]。

超氧化物歧化酶活力測定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)法[16]。將50 μL 樣品加入到3 mL 反應(yīng)溶液(50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，0.75 mmol/L 氯化硝基四氮唑藍(lán)，20 μmol/L核黃素，13 μmol/L 甲硫氨酸，pH 7.8)中混勻，30 ℃使用4000 lx 熒光照射 5 min，測定560 nm 波長下的吸光值。1 mL 反應(yīng)液中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)50%時(shí)定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

采用多巴絡(luò)合物生成法測定酚氧化酶活力[17]。將100 μL樣品加入到2 mL左旋多巴溶液(15 mmol/L)中混勻，測定490 nm波長下的吸光值，每隔3 min測量一次，共測量10次，吸光值每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

過氧化氫酶活力測定[6]，將50 mmol/L, pH 7.5的磷酸緩沖液加入75 mmol/L濃度的H2O2中，直至240 nm波長吸光值達(dá)到0.04～0.06，用作底物緩沖液。將100 μL樣品加入到2.9 mL底物緩沖液中，混勻測定240 nm波長下的吸光值。每秒鐘轉(zhuǎn)化1 μmol H2O2定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)量濃度[18]。50 μL樣品與50 μL 0.15 mol/L NaCl溶液混勻，加入到1 mL 考馬斯亮藍(lán)測試液(25 mg 考馬斯亮藍(lán)G-250，25 mL 85%磷酸，12.5 mL 95% 乙醇，用超純水定容至250 mL)中，5 min后測定595 nm 波長下的吸光值。蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線使用牛血清白蛋白繪制(mg/L)。

仿刺參體腔細(xì)胞的酶活力以比活力(1 mg蛋白樣品中所含有的酶活力單位)表示(U/mg)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有酶活力檢測試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05定義為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中酸性磷酸酶活力變化

試驗(yàn)菌株刺激后12 h，仿刺參體腔細(xì)胞中的酸性磷酸酶活力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中蠟樣芽孢桿菌組活性急劇升高至約對(duì)照組的3倍。刺激后24 h，假交替單胞菌組仿刺參體腔細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶的活性顯著降低，其余3種試驗(yàn)菌組酶活性仍高于對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)。蠟樣芽孢桿菌組體腔細(xì)胞中的酸性磷酸酶活性始終高于對(duì)照組(圖1)。

圖1 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中酸性磷酸酶活力的變化*表示與對(duì)照相比差異顯著.

2.2 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中堿性磷酸酶活力的變化

4種試驗(yàn)菌株刺激在短時(shí)間(4、12 h)內(nèi)均引起仿刺參體腔細(xì)胞中堿性磷酸酶活性急劇增加，其中希瓦氏菌刺激后4 h酶活力升高最明顯，比對(duì)照組高3.5 U/mg(圖2)。

圖2 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中堿性磷酸酶活力的變化

2.3 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中酚氧化酶活力的變化

試驗(yàn)菌株刺激后，仿刺參體腔細(xì)胞中酚氧化酶活力在短時(shí)間內(nèi)就明顯下降，長時(shí)間保持在較低水平。其中假交替單胞菌刺激后4 h，體腔細(xì)胞中的酚氧化酶活力降低最為明顯，比對(duì)照組降低約6倍(圖3)。

圖3 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中酚氧化酶活力的變化

2.4 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中超氧化物歧化酶活力的變化

燦爛弧菌刺激后4 h，仿刺參體腔細(xì)胞中超氧化物歧化酶活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，之后持續(xù)下降，12 h與對(duì)照組持平，24 h后顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。假交替單胞菌和蠟樣芽孢桿菌刺激后4 h，體腔細(xì)胞中超氧化物歧化酶活力均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，但12 h明顯升高，其中蠟樣芽孢桿菌刺激后12 h體腔細(xì)胞中的超氧化物歧化酶活力比對(duì)照組高40 U/mg。希瓦氏菌刺激組體腔細(xì)胞中的超氧化物歧化酶活性始終低于對(duì)照組(圖4)。

圖4 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中超氧化物歧化酶活力的變化

2.5 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中過氧化氫酶活力變化

受到試驗(yàn)菌株刺激后，短時(shí)間內(nèi)(4、12 h)仿刺參體腔細(xì)胞中過氧化氫酶活力均高于對(duì)照組。其中燦爛弧菌刺激后4 h酶活力達(dá)最高，其余菌株刺激后12 h酶活力達(dá)最高。蠟樣芽孢桿菌刺激后12 h，體腔細(xì)胞中過氧化氫酶活力提高最為明顯，是對(duì)照組的12.8倍(增加1847.4 U/mg)(圖5)。

圖5 試驗(yàn)菌株刺激后仿刺參體腔細(xì)胞中過氧化氫酶活力變化

3 討 論

體腔細(xì)胞是仿刺參非特異性免疫系統(tǒng)中細(xì)胞免疫的主要承擔(dān)者[5]。已有的報(bào)道表明，仿刺參體腔細(xì)胞中的多種免疫因子可有效應(yīng)答病原菌的刺激[19-21]。然而，仿刺參體腔細(xì)胞中的免疫相關(guān)酶在不同病原菌刺激后的應(yīng)答特性尚不明確。

3.1 磷酸酶免疫應(yīng)答分析

本試驗(yàn)表明，燦爛弧菌、假交替單胞菌、希瓦氏菌和蠟樣芽孢桿菌刺激后12 h，仿刺參體腔細(xì)胞中的酸性磷酸酶活力均顯著升高，表明體腔細(xì)胞中該酶可有效應(yīng)答上述4種病原菌的入侵。然而，前期研究發(fā)現(xiàn)，假交替單胞菌和燦爛弧菌刺激后4 h，仿刺參體腔液上清中的酸性磷酸酶活力就顯著升高[22]。因此可以推測，在仿刺參應(yīng)答燦爛弧菌和假交替單胞菌過程中，體腔細(xì)胞中酸性磷酸酶介入要晚于體腔液上清中的酸性磷酸酶，這與受大腸桿菌(Escherichiacoli)感染櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)血細(xì)胞和血清中酸性磷酸酶活力變化相似[23]。體腔細(xì)胞中酸性磷酸酶活力的最高值出現(xiàn)在蠟樣芽孢桿菌(G+)刺激后，體腔液上清中酸性磷酸酶活力的最高值則出現(xiàn)在停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)(G+)刺激后[22]，表明仿刺參體內(nèi)酸性磷酸酶可能在應(yīng)對(duì)革蘭氏陽性菌的入侵中發(fā)揮重要免疫作用。4種病原菌刺激后4 h和12 h，仿刺參體腔細(xì)胞中堿性磷酸酶活力均顯著高于對(duì)照組，表明堿性磷酸酶在短時(shí)間內(nèi)能積極有效參與仿刺參對(duì)上述4種細(xì)菌的免疫應(yīng)答，這與燦爛弧菌刺激仿刺參后體腔液的免疫應(yīng)答[22]和鰻弧菌(V.anguillarum)刺激青蛤(Cyclinasinensis)[24]的研究結(jié)果一致。

3.2 酚氧化酶免疫應(yīng)答分析

受到病原刺激后，櫛孔扇貝[6]和斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[25]等水生無脊椎動(dòng)物酚氧化酶快速產(chǎn)生了顯著變化。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也證明了酚氧化酶是仿刺參非特異性免疫系統(tǒng)中最敏感、高效的免疫因子之一[22]。4種病原菌刺激后，仿刺參體腔細(xì)胞酚氧化酶的活力均低于對(duì)照組，說明仿刺參體腔細(xì)胞中的酚氧化酶無法有效應(yīng)答病原菌的入侵，這可能是4種細(xì)菌具有致病性的潛在原因之一。

3.3 抗氧化酶免疫應(yīng)答分析

超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是無脊椎動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化酶[11,26]，是衡量動(dòng)物機(jī)體免疫能力的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，仿刺參受燦爛弧菌刺激后4 h，超氧化物歧化酶活性顯著高于對(duì)照組，隨后開始下降；假交替單胞菌和蠟樣芽孢桿菌刺激后12 h，超氧化物歧化酶活力顯著高于對(duì)照組；希瓦氏菌刺激組體腔細(xì)胞中的超氧化物歧化酶活力始終低于對(duì)照組。上述結(jié)果表明，仿刺參體腔細(xì)胞中的超氧化物歧化酶可有效應(yīng)答燦爛弧菌、假交替單胞菌和蠟樣芽胞桿菌的入侵，但其活力可能受到希瓦氏菌的抑制。雜色鮑(Haliotisdiversicolor)血淋巴中的超氧化物歧化酶活力受到大腸桿菌激活和副溶血弧菌(V.parahemolyticus)抑制[27]。以上結(jié)果說明超氧化物歧化酶對(duì)不同病原菌的免疫反應(yīng)不同。仿刺參受到4種病原菌刺激后，短時(shí)間內(nèi)過氧化氫酶的活力高于對(duì)照組，但隨著時(shí)間延長其免疫應(yīng)答降低并恢復(fù)到正常水平，表明過氧化氫酶屬于急性應(yīng)激蛋白，在病原菌的早期免疫應(yīng)答中起重要作用，這與鰻弧菌、大腸桿菌激活櫛孔扇貝過氧化氫酶活力的結(jié)果一致[24,28]。

4 結(jié) 論

綜上所述，燦爛弧菌、假交替單胞菌、希瓦氏菌、蠟樣芽孢桿菌這4株試驗(yàn)菌株刺激仿刺參后，短時(shí)間內(nèi)體腔細(xì)胞中的兩種水解酶(酸性和堿性磷酸酶)都發(fā)揮了重要的免疫防御作用，其中酸性磷酸酶對(duì)革蘭氏陽性的蠟樣芽孢桿菌起到更有效的免疫應(yīng)答。超氧化物歧化酶受到希瓦氏菌的抑制，酚氧化酶對(duì)4種病原菌均無法產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，表明這幾株病原菌對(duì)仿刺參的免疫系統(tǒng)具有一定的適應(yīng)性，這可能是它們導(dǎo)致仿刺參病發(fā)的主要原因之一。

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