四妙勇安湯對大鼠尾動脈血管吻合術(shù)后吻合口再狹窄及VEGF蛋白的影響*

劉 鑫 雷儒萌 歐 梁△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

斷指再植是手外科常見急診手術(shù)，是指借助顯微外科技術(shù)將離斷肢體的血管、骨、神經(jīng)、肌腱及皮膚進(jìn)行重建，以最大程度恢復(fù)肢體的循環(huán)、外形及功能的一種治療手段。令人欣慰的是我國創(chuàng)傷顯微外科技術(shù)在全球處于領(lǐng)先水平，據(jù)文獻(xiàn)報道，我國斷指再植成活率達(dá)90%以上［1]。但是作為一名手外科醫(yī)師，應(yīng)該更加重視那些因再植手術(shù)失敗而承受肢體缺失痛苦的患者。研究發(fā)現(xiàn)［2]，血管吻合術(shù)后吻合口再狹窄是導(dǎo)致手術(shù)失敗的重要原因，因此，如何抑制吻合口再狹窄機(jī)制的發(fā)生以提高血管吻合通暢率是現(xiàn)代顯微外科醫(yī)師的重大課題。四妙勇安湯始見于華佗《神醫(yī)秘傳》之中，臨床常用于治療熱毒熾盛所致的血栓閉塞性脈管炎、靜脈炎等血脈疾患。本課題組試從中醫(yī)絡(luò)病學(xué)角度進(jìn)行探索，將斷指再植術(shù)后辨病為“絡(luò)病”范圍，確立 “清熱解毒，活血通絡(luò)”的基本治法，選用四妙勇安湯為研究方藥，探討其對大鼠尾動脈血管吻合術(shù)后吻合口再狹窄、血管內(nèi)膜增生情況及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的影響，從而為臨床實踐提供理論支持?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康的雄性成年SD大鼠共27只，月齡12周，體質(zhì)量220～250 g，SPF級。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供［許可證號：SYXK（湘）2013-0005]。實驗室溫度處于22～26℃，濕度45%～65%之間，整個試驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會同意和審查。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：四妙勇安湯生藥（金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草）均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，按原方比例 3∶3∶2∶1 抓取，將生藥全部浸入清水之中，等待其浸泡0.5 h后開始煎煮，頭次煎煮時間1 h，煎煮過濾后留取藥汁備用，再次煎煮1 h，過濾后留取藥汁，將兩次煎煮藥汁混合，再通過離心機(jī)去沉渣，去沉渣后的藥汁，經(jīng)80℃水浴鍋蒸發(fā)濃縮處理，制備藥汁生藥含量為4.5 g/mL的中藥湯劑，冷藏保存?zhèn)溆谩?.9%氯化鈉注射液（湖南科倫制藥有限公司，批號H16102701）；水合氯醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號 H20151207）；肝素鈉注射液（南京健友生化制藥股份有限公司，批號H20153024）；枸櫞酸鹽緩沖液（Wellbio，批號 H20158403）；二步法試劑盒（中杉金橋，批號 H20152433）；DAB試劑盒（中杉金橋，批號H20156213）。2）儀器：DYY-6C型恒溫箱（北京六一公司）；TS-92型搖床（海門其林貝爾公司）；M199型切片刀（德國萊卡公司）；YD-315型切片機(jī)（浙江金華益迪試驗設(shè)備公司）；BA210T型顯微鏡（Motic公司）；BMJ-A型包埋機(jī)（常州中威電子儀器公司）。

1.3 實驗方法 雄性成年SD大鼠共24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按照隨機(jī)數(shù)字表以1∶1的比例分為四妙勇安湯組和生理鹽水組。參考文獻(xiàn)［3-4]的造模方法，并結(jié)合本次實驗特點，造模步驟如下：造模前預(yù)先配置標(biāo)準(zhǔn)10%水合氯醛溶液及肝素鹽水，按0.35 mL/100 g的麻醉用藥劑量腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將大鼠置于固定臺，采取仰臥位.按照無菌手術(shù)原則消毒鋪巾，取大鼠尾部腹側(cè)正中距尾根約2 cm處作腹側(cè)縱形切口，切口長度約2 cm，逐層在10倍手術(shù)顯微鏡下使用專用顯微手術(shù)器械分離大鼠尾部腹側(cè)正中結(jié)締組織以及動脈鞘，充分顯露、游離大鼠尾部腹側(cè)正中尾動脈，顯露游離好后，選用兩枚無創(chuàng)血管夾，分別夾住血管的近心端、遠(yuǎn)心端阻斷血流，再用銳利的顯微外科剪垂直橫斷血管。血管離斷后，顯露血管斷端，運用預(yù)先配置的肝素鹽水沖洗血管管腔并予以液壓擴(kuò)張管腔，其后術(shù)中間斷使用肝素鹽水沖洗以清晰視野，修剪外膜后將兩枚無創(chuàng)血管夾稍合攏，根據(jù)血管直徑選擇粗細(xì)適宜的9-0至11-0無創(chuàng)縫合線，在無張力的情況下將離斷血管端-端內(nèi)膜外翻吻合，吻合后對吻合血管進(jìn)行血管充盈試驗，確認(rèn)其通血成功，再輕柔操作閉合創(chuàng)口，待大鼠清醒，觀察無異常反應(yīng)后放回飼養(yǎng)籠中。兩組均在術(shù)后12 h灌胃，四妙勇安湯以2mL/只的劑量灌胃，對照組予以等劑量0.9%氯化鈉注射液灌胃，兩組灌胃均每日2次，于術(shù)后第3日、第7日，末次灌胃2 h后，分批留取吻合口處血管組織標(biāo)本并斷頭處死動物，兩個時間段每組大鼠各6只。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）HE染色觀察血管組織形態(tài)學(xué)變化。取大鼠腹側(cè)正中尾動脈血管吻合部位附近長約1 cm血管組織，及時置入4%多聚甲醛溶液之中浸泡固定。待組織標(biāo)本在用不同梯度的乙醇中脫水后，置于石蠟中包埋、切片，行HE染色并鏡下觀察。2）免疫組織化學(xué)染色檢測組織中VEGF的表達(dá)。將制備好的切片進(jìn)行60℃烤片，時間為30～60 min，拷片后的切片進(jìn)行脫蠟以及水化處理，再熱修復(fù)抗原，再之后加入預(yù)先備好的3%H2O2溶液，在室溫之下等待10min以滅活血管組織標(biāo)本的內(nèi)源性活性酶。孵育一抗：滴加適當(dāng)稀釋的一抗（VEGF），在4℃的環(huán)境之中過夜。PBS液體沖洗5 min×3次，孵育二抗：再滴加50～100μL鼠IgG抗體-HRP多聚體處理，37℃的環(huán)境之中孵育30 min，PBS液體沖洗5min×3次。經(jīng)過以上處理后滴加預(yù)先制備好待用的顯色劑DAB液。再次運用蘇木素處理，復(fù)染5～10min之后，運用大量蒸餾水沖洗，沖洗后再經(jīng)PBS液體處理使顏色返藍(lán)；最后再經(jīng)過不同等級溶度的酒精（60%～100%）進(jìn)行脫水處理，每級處理時間為5min。取出后將切片小心置入二甲苯之中，需要置入10 min，重復(fù)2次，之后再用中性的樹膠進(jìn)行封片處理，處理后置于顯微鏡下查看分析。陽性染色為黃色或棕黃色（深的可至褐色）染色。3）圖像分析處理。采用圖像分析軟件IPP6.0（Image-Pro-Plus 6.0）分析鏡下攝像，計算出血管橫斷面管腔面積（LA）、內(nèi)彈力板包繞面積（IELA）、外彈力板包繞面積（EELA），再計算出內(nèi)膜面積（IA）=IELA–LA；增生面積（PA）=EELALA；以PA/EELA比值評估管腔狹窄程度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，資料滿足正態(tài)性與方差齊性，采用配對t檢驗，不滿足則采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色及血管內(nèi)膜增生情況結(jié)果分析 見圖1，圖2，表1。鏡下觀察到大鼠尾動脈血管壁內(nèi)、中、外3層層次分明（圖1）。經(jīng)IPP 6.0處理獲得的內(nèi)膜面積數(shù)據(jù)資料發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，實驗組在術(shù)后第3日、第7日的血管內(nèi)膜面積都明顯增加，差異性均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表 1，圖 2），說明四妙勇安湯在血管吻合修復(fù)術(shù)后能有效促進(jìn)血管內(nèi)膜增生修復(fù)。

圖1 大鼠尾動脈吻合口血管（HE染色，400倍）

圖2 各項測量指標(biāo)結(jié)果

表1 兩組不同時間段血管內(nèi)膜各項測量指標(biāo)結(jié)果比較（±s）

表1 兩組不同時間段血管內(nèi)膜各項測量指標(biāo)結(jié)果比較（±s）

與生理鹽水組比較，*P＜0.05。

組 別 時 間 血管組織VEGF蛋白表達(dá)（平均光密度值）血管內(nèi)膜面積（μm2）血管腔狹窄程度（%）四妙勇安湯 術(shù)后3 d 0.17±0.01*（n＝6） 術(shù)后 7 d 0.20±0.01*生理鹽水組 術(shù)后3 d 0.13±0.01 2258.85±141.68* 58.81±1.77*2891.69±115.76* 64.26±1.18*1979.53±107.12 62.41±1.91（n＝6） 術(shù)后 7 d 0.15±0.01 2420.60±106.15 66.58±1.62

2.2 各組管腔狹窄程度比較 見表1，圖2。以PA/EELA（%）的比值評估修復(fù)后血管腔狹窄程度。兩組術(shù)后第3日、第7日的PA/EELA比值差異性比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），證明四妙勇安湯能有效預(yù)防血管吻合術(shù)后吻合口再狹窄。

2.3 免疫組化檢測血管組織VEGF蛋白表達(dá) 見表1，圖2，圖3。光鏡下判斷VEGF蛋白陽性表達(dá)為黃色或棕黃色（見圖3），染色以平均光密度值評估VEGF蛋白的表達(dá)程度，與對照組比較，實驗組在術(shù)后第3日、第7日的平均光密度值均明顯增高（P＜0.05）（見表1，圖2），表明四妙勇安湯能有效刺激VEGF蛋白的表達(dá)。

圖3 大鼠尾動脈吻合口血管免疫組化（HE染色，400倍）

3 討 論

隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展，顯微外科技術(shù)愈發(fā)成熟，手術(shù)成功率大為提升，但顯微外科醫(yī)生面對著血管吻合術(shù)后吻合口再狹窄導(dǎo)致血管吻合遠(yuǎn)期通暢率難以提高的狀況仍然客觀存在［5]。血管吻合術(shù)后吻合口再狹窄的發(fā)生是一個非常復(fù)雜的病理生理過程，其發(fā)生的過程可能涉及多種因子與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與［6]。目前，西醫(yī)對于血管吻合術(shù)后預(yù)防血管堵塞的治療主要包括有：一般性治療，如囑患者臥床休息，防寒保暖，戒煙、戒酒，調(diào)節(jié)情志等；藥物對癥治療，如應(yīng)用抗凝、抗感染、抗痙攣、止痛等治療藥物，改善血管狀態(tài)，保持血流通暢［7]。雖然這些治療措施已經(jīng)為血管的再通創(chuàng)造了較好條件，但是遠(yuǎn)期通暢率仍有待進(jìn)一步提高。

因此，從中醫(yī)絡(luò)病學(xué)角度進(jìn)行探索，為治療血管吻合口再狹窄提供治療手段，以提高血管損傷修復(fù)后通暢率，是非常必要的。血管損傷中醫(yī)辨病為“絡(luò)病”范圍，絡(luò)脈是人體氣血津液運行輸布的通道，在人體內(nèi)縱橫交貫遍布全身，形成一個網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，將人體臟腑、肢體等相互聯(lián)系構(gòu)成為一個有機(jī)的整體［8]。因此，可以將血管損傷發(fā)生的基本病機(jī)過程歸納總結(jié)為：邪氣犯絡(luò)，絡(luò)道受邪，損傷絡(luò)道，氣血凝澀，輸布環(huán)流受阻，而釀生毒瘀，毒侵絡(luò)道，致邪盛于正，正氣受損，絡(luò)虛邪郁，致絡(luò)脈瘀滯?；趯ρ軗p傷中醫(yī)病因病機(jī)的理解及深刻認(rèn)識，確立“清熱解毒，活血通絡(luò)”為血管損傷的基本治則。

四妙勇安湯目前臨床廣泛用于治療心血管及周圍血管疾病，療效確切［9-10]。本方由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草四味藥組成，方中金銀花為君藥，被古人譽為是清熱解毒的良藥；玄參為臣藥，具有滋陰瀉火之效，與金銀花配伍能輔助加強(qiáng)清熱解毒的效應(yīng)；當(dāng)歸為佐藥，具有補血調(diào)經(jīng)、化瘀活血通絡(luò)之效；甘草為使藥調(diào)和諸藥，全方藥味少，效用專，具有清熱解毒、活血通絡(luò)的作用。同時，現(xiàn)代藥理研究已證實四妙勇安湯具有抗凝血、抑制血小板聚集、抗血栓形成、擴(kuò)張血管、促進(jìn)纖維蛋白溶解、保護(hù)血管、改善血流動力學(xué)指標(biāo)、抗炎、抗氧化、穩(wěn)定斑塊和降脂等作用［11-12]。

本研究中，采用大鼠尾動脈完全離斷后在顯微鏡下施行血管吻合術(shù)的方法造模，符合該病的發(fā)病機(jī)制。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以血管內(nèi)膜面積評估血管內(nèi)膜增生情況，在術(shù)后的第3日和第7日，四妙勇安湯組吻合口處血管內(nèi)膜細(xì)胞增生更加迅速、穩(wěn)定，說明四妙勇安湯可以促進(jìn)損傷處血管的修復(fù)進(jìn)程；以PA/EELA比值評估血管管腔狹窄程度，生理鹽水組血管腔變得更為狹窄，阻塞血液運行，說明四妙勇安湯能有效預(yù)防血管吻合術(shù)后吻合口再狹窄；以平均光密度值評估VEGF蛋白表達(dá)程度，術(shù)后第3日、第7日的四妙勇安湯組血管中VEGF蛋白表達(dá)量上調(diào)，表明四妙勇安湯能有效刺激VEGF蛋白的生成。VEGF蛋白是一種能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物活性物質(zhì)，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂、復(fù)制增殖，并提高血管的通透性，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)構(gòu)建新生血管外基質(zhì)，為血管新生提供良好環(huán)境［13-15]。

綜上，四妙勇安湯通過清熱解毒，活血通絡(luò)，可以促進(jìn)大鼠損傷血管處血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加快血管修復(fù)，并能夠刺激VEGF蛋白表達(dá)，從而預(yù)防吻合口再狹窄的發(fā)生。而且，四妙勇安湯預(yù)防血管吻合術(shù)后吻合口再狹窄其作用的發(fā)生可能是通過多種途徑實現(xiàn)的，其具體的效應(yīng)機(jī)制還需要進(jìn)一步實驗去證明。

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