離子液體的制備及其在酶催化中的應(yīng)用進(jìn)展

王明啟，杜仕國，閆 軍，俞衛(wèi)博，孟勝皓，李 晨

(陸軍工程大學(xué) 石家莊校區(qū)彈藥工程系， 石家莊 050003)

離子液體(Ionic liquids,ILs)是由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子組成的一種鹽類化合物，且陰、陽離子數(shù)目相等，因而整體呈現(xiàn)電中性。組成ILs的陰、陽離子具有高度的不對稱特性，不易密集堆積，難以結(jié)晶固化，因此，在室溫條件下為液體狀態(tài)，通常也被稱為“室溫離子液體”、“室溫熔鹽”[1]。相比于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑(如醛類、醇類、鹵代烷烴等)的易揮發(fā)、易燃、易爆、低毒等性質(zhì)，ILs的物理、化學(xué)性質(zhì)均較為穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的溶解能力、良好的導(dǎo)電性能、較寬的液體范圍(大約為-90 ℃～400 ℃)，并以其非揮發(fā)性以及較強(qiáng)的催化活性等特點(diǎn)，讓人們看到了替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的希望[2-4]。ILs不易揮發(fā)(蒸汽壓近似為零)，且易于回收循環(huán)再利用，故此，是一種理想的“綠色溶劑”[5-6]。

ILs的最早出現(xiàn)可追溯到1914年，Walden等制備的硝酸乙基胺([EtNH3][NO3])，其熔點(diǎn)為12 ℃，且極易爆炸，這一發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時并未受到足夠的重視，很快就被人們遺忘。直至1992年，美國空軍研究院Wilkes等[7]制備出了ILs 二烷基咪唑類四氟硼酸[Emim][BF4]，之后，對于ILs的研究才開始迅速發(fā)展。近幾年，隨著綠色化學(xué)理念的深入人心，在國內(nèi)外掀起了對ILs的研究熱潮。特別是以ILs為介質(zhì)的酶催化過程，酶分子表現(xiàn)出了比其在水和有機(jī)溶劑中更高的熱穩(wěn)定性、催化活性、綠色性，已成為酶催化領(lǐng)域的研究前沿課題。

1 分類

現(xiàn)階段所研究的ILs，均由陰離子[B]-和陽離子[A]+組成，結(jié)構(gòu)表示為[A]+[B]-，其分類可按陰、陽離子組成的不同進(jìn)行劃分。根據(jù)陽離子的不同，通?？蓪Ls分為吡啶鹽、咪唑鹽、季銨鹽和季膦鹽4類，如表1所示。

表1 根據(jù)陽離子的不同分類

其中以對烷基取代的咪唑類ILs的研究最早且研究最多。根據(jù)陰離子的不同，通?？蓪Ls分為鹵化鹽、非鹵化鹽2類，如表2所示。

表2 根據(jù)陰離子的不同分類

理論上，根據(jù)陰離子和陽離子的不同排列方式，ILs的種類可達(dá)1018種，可具有應(yīng)用價值并被實(shí)際應(yīng)用的卻不多[8-10]。

2 制備方法

ILs制備方法分為傳統(tǒng)制備法和輔助合成法，其中傳統(tǒng)制備法包括一步合成法和兩步合成法；輔助合成法包括超聲波法、微波法及電化學(xué)法。

2.1 一步合成法

一步合成法即直接合成法，指通過季銨化反應(yīng)或者酸堿中和反應(yīng)一步合成目標(biāo)產(chǎn)物。如EtNH2和HNO3的水溶液進(jìn)行酸堿中和反應(yīng)制備ILs [EtNH3][NO3]。反應(yīng)式為：

此外，具有1,3-對稱取代的咪唑類ILs也可以通過一步合成法制得。

該法具有操作簡便，經(jīng)濟(jì)時效，無副產(chǎn)物，產(chǎn)品易純化等特點(diǎn)。

2.2 兩步合成法

第一步，鹵代烷烴和含目標(biāo)陽離子的化合物進(jìn)行季銨化反應(yīng)制得含目標(biāo)陽離子的鹵化物鹽；第二步，用含目標(biāo)陰離子的酸或鹽和上述鹵化物鹽進(jìn)行陰離子交換，得到目標(biāo)產(chǎn)物。例如典型的烷基吡啶類ILs的制備(圖1)：

圖1 兩步合成法制備烷基吡啶類ILs

該法的優(yōu)點(diǎn)是普適性好、收率高，缺點(diǎn)是伴隨有其他副產(chǎn)物產(chǎn)生。四氟硼酸鹽、六氟磷酸鹽等ILs通常就是采用兩步合成法制備。

2.3 輔助合成法

傳統(tǒng)合成法常以加熱的方式提高反應(yīng)速率，即便如此，反應(yīng)完成也需很長時間，而輔助技術(shù)的運(yùn)用，可有效加速ILs的合成，產(chǎn)品的純度和收率也較傳統(tǒng)方法有所提高，且減少了制備過程中所需大量的有機(jī)試劑，符合綠色化學(xué)的理念。

2.3.1 超聲輔助合成法

超聲輔助合成法是通過攪拌作用和超聲空化作用加快ILs合成的速率，對非均相催化反應(yīng)效果更佳[11]。

Leveque等[12]利用超聲輔助技術(shù)在常溫條件下以30 kHz的微波輻射原料1h，制備了ILs 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(圖2)。結(jié)果表明：反應(yīng)時間比傳統(tǒng)方法短很多，且產(chǎn)率提高80%～90%。

圖2 超聲輔助合成1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽

李學(xué)琴等[13]以N-甲基咪唑、2-氯乙醇為原料，利用超聲波輔助技術(shù)合成了N-(2-羥乙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C2OHmim])(圖3)。相比較于傳統(tǒng)加熱法制備過程，合成反應(yīng)時間由原來的24～48 h縮短至4 h，產(chǎn)率提高至57.69%。

該法的優(yōu)點(diǎn)是能耗低，反應(yīng)速率快，合成條件簡單，可制備傳統(tǒng)方法不易制備新型ILs[14]。

圖3 超聲輔助合成N-(2-羥乙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽

2.3.2 微波輔助合成法

微波輔助合成法的原理是極性分子在快速變化的電磁環(huán)境里不斷改變方向，使分子因摩擦而溫度升高，同時無規(guī)則運(yùn)動的分子可視為分子攪拌的作用，顯著提高了目標(biāo)ILs的產(chǎn)率[15]。

侯金松等[16]采用微波輻射技術(shù)，以N-甲基咪唑、正溴丁烷以及四氟硼酸銨作為原料，制備了ILs [Hmim][BF4](圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用微波技術(shù)不僅使反應(yīng)時間大大減少，且將目標(biāo)ILs的產(chǎn)率提高到97.2%。

圖4 微波輔助合成[Hmim][BF4]

陸麗新[17]使用Discover微波精密有機(jī)合成反應(yīng)器，合成了ILs四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑，并探究了反應(yīng)功率、反應(yīng)時間等因素對反應(yīng)的影響(圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：采用微波技術(shù)不僅使反應(yīng)時間大大減少，不及常規(guī)合成法的10%，且將目標(biāo)ILs的產(chǎn)率提高30%以上。

圖5 微波輔助合成四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑

該法的優(yōu)點(diǎn)是所需有機(jī)溶劑少或不需要有機(jī)溶劑，反應(yīng)速率快，產(chǎn)品產(chǎn)率高；缺點(diǎn)是微波反應(yīng)器的價格比較昂貴，且微波在ILs合成過程中不易控制，伴隨著副反應(yīng)的發(fā)生易出現(xiàn)過熱的現(xiàn)象，很難在工業(yè)上大規(guī)模運(yùn)用[18]。

2.3.3 電化學(xué)輔助合成法

電化學(xué)輔助合成法的原理是選用含目標(biāo)陽離子的鹽類化合物(季銨鹽、硫鎓鹽或含氮雜環(huán)等)，其陰離子經(jīng)電解可轉(zhuǎn)化成二氧化碳或氮?dú)獾?；選用含目標(biāo)陰離子的化合物(硝酸、醋酸等)，其陽離子經(jīng)電解可轉(zhuǎn)化為氫氣、氮?dú)獾取㈦娊馍傻臍怏w從電解池移出，剩余的陰離子和陽離子經(jīng)電解池中的離子交換膜合成目標(biāo)產(chǎn)品[19]。以ILs [Bmim][Ac]的合成為例(圖6)。

圖6 電化學(xué)輔助合成[Bmim][Ac]

該法的優(yōu)點(diǎn)是可制備不含鹵素離子的ILs，且純度很高，可達(dá)99.99%。但該法的缺點(diǎn)是操作和制備裝置較復(fù)雜，目前，不適于大規(guī)模的工業(yè)合成。

3 ILs在生物酶催化領(lǐng)域中的應(yīng)用

酶催化又名生物催化，是指利用生物催化劑將原料徹底轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的過程。酶催化具有高效選擇性、反應(yīng)速度快、綠色環(huán)保、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑通常限制了酶的催化活性和選擇性，使反應(yīng)體系受到了諸多限制[20]。而ILs的運(yùn)用，不僅在很大程度上改善了上述現(xiàn)狀，更為酶催化領(lǐng)域開辟了一條新的綠色的途徑。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，許多酶在ILs介質(zhì)中不僅不會失活，而且選擇性、催化活性、穩(wěn)定性都有很大的提升[21-23]。除少數(shù)酶在ILs中活性下降甚至活性喪失，例如嗜熱菌蛋白酶在[Bmim][PF6]中催化活性降低，甚至無催化活性[24]。近年來，隨著人們對ILs中酶催化反應(yīng)研究的不斷深入，ILs已被廣泛應(yīng)用于蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、氧化還原酶等酶分子的催化過程，取得了很好的效果。

3.1 ILs中蛋白酶催化反應(yīng)

蛋白酶作為最重要的工業(yè)酶制劑，可高效催化多肽和蛋白質(zhì)的水解，與ILs的協(xié)同運(yùn)用，使酶的催化活性得到有效提高。

第一個在ILs介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)生物酶催化轉(zhuǎn)化的酶即是蛋白酶。2000年，Erbeldinger等[25]在ILs [Bmim][PF6](含5%H2O，體積分?jǐn)?shù))中以嗜熱菌蛋白酶作催化劑，催化合成Z-天(門)冬氨酰苯丙氨酸甲酯(又名“阿斯巴甜”，APM)，轉(zhuǎn)化率為40%，產(chǎn)率高達(dá)95%，且ILs易與產(chǎn)物分離，可重復(fù)再利用(圖7)。

圖7 嗜熱菌蛋白酶在[Bmim][PF6]中催化合成APM

文獻(xiàn)[25]被當(dāng)作綠色溶劑與綠色生物合成相結(jié)合的標(biāo)志，讓人們看到了ILs在酶催化領(lǐng)域取代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的希望[26]。自此，ILs中的酶催化反應(yīng)得到了廣泛的關(guān)注[27-30]。

Wehofsky等[31]指出，胰凝乳蛋白酶在ILs [Mmim][Me2PO4]和嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)雙體系(體積比7∶3,此時催化效果最好)中，其與蛋白質(zhì)亞基的連接產(chǎn)率比在單一MOPS體系中高42.3%，達(dá)到87.4%；在與上述相同的環(huán)境條件下，胰蛋白酶與蛋白質(zhì)亞基的連接產(chǎn)率是在純MOPS體系中的4.22倍，達(dá)到79.7%。

袁久剛等[32]使用ILs 1-丁基-3-甲基咪唑([Bmim][Cl])在100 ℃溫度下處理羊毛10 min，再用蛋白酶催化羊毛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羊毛經(jīng)ILs處理后，蛋白酶對纖維的水解程度明顯提高，使織物的表面自由能下降，潤濕性能提高。

侯雪丹等[33]對木瓜蛋白酶(Papain)在ILs中催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯水解的活性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所選用的ILs中，大部分帶有[PF6]-、[BF4]-的ILs對Papain的活性或熱穩(wěn)定性起促進(jìn)作用，在ILs [Bmim][PF6]中Papain的水解活性最高，在ILs [HOEtmim][BF4]中，其熱穩(wěn)定性最好。

3.2 ILs中脂肪酶催化反應(yīng)

脂肪酶(Lipase)又名甘油酯水解酶，三酰基甘油?；饷?，是指能將甘油三酯逐步水解成甘油和脂肪酸的一類酶[34-36]。截至目前，由于脂肪酶可在多種ILs中穩(wěn)定存在，且能進(jìn)行多種類型的催化反應(yīng)，所以人們對脂肪酶在ILs體系中的運(yùn)用與研究最多[37]。

早在2000年，Lau等[38]第一次證明了ILs可用于生物催化體系的可能性，他們利用脂肪酶(固定化酶Nov435、游離酶SP525)在ILs([Bmim][PF6]、[Bmim][BF4])中催化正丁醇與丁酸乙酯合成丁酸丁酯，反應(yīng)時間4 h，產(chǎn)率近81%。

Lee等[39]探究了脂肪酶(Novozym435)在ILs [Bmim][TfO]/[Bmim][Tf2N]雙體系(體積比1∶1)中催化月桂酸乙烯酯和葡萄糖的轉(zhuǎn)化成酯的反應(yīng)，產(chǎn)品葡萄糖酯的產(chǎn)率近69%，對反應(yīng)后的脂肪酶進(jìn)行回收再利用，脂肪酶的催化活性仍較高。

Kurata等[40]在ILs [Bmim][Tf2N]介質(zhì)的存在下，利用脂肪酶催化苯乙醇與咖啡酸甲酯合成咖啡酸苯乙酯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與在單獨(dú)有機(jī)相中反應(yīng)相比，反應(yīng)速率大幅度提升，原料的轉(zhuǎn)化率高達(dá)93.8%。

Li等[41]探究了烷基咪唑型ILs對脂肪酶催化水解反應(yīng)活性的影響因素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ILs中陽離子的烷基鏈長和陰離子的類型對酶活性的影響較大，在最適宜的環(huán)境條件下，ILs [C8mim][Br]對脂肪酶活性的促進(jìn)作用最大，酶的相對活力最高可達(dá)1734%，該結(jié)果有利于人們更清楚的認(rèn)識ILs的結(jié)構(gòu)和酶活性之間的關(guān)系。

李明等[42]以脂肪酶CRL在ILs 1,3-二正辛基咪唑六氟磷酸鹽([DnOIM][PF6])中催化丙酸酐和薄荷醇合成丙酸薄荷酯(圖8)。結(jié)果表明：CRL在[DnOIM][PF6]中的催化活性很大提高，且穩(wěn)定性是常用有機(jī)溶劑正己烷的4.3倍，CRL經(jīng)回收循環(huán)利用7次后，其催化活性仍無明顯下降。

圖8 在[DnOIM][PF6]中CRL催化合成丙酸薄荷酯

蘇二正等[43]研究了不同種ILs介質(zhì)對木瓜脂肪酶(CPL)催化伯醇類萜烯醇(香葉醇和香茅醇)與乙酸乙烯酯合成萜烯醇芳香酯的實(shí)驗(yàn)影響。結(jié)果表明，CPL在具有陰離子[PF6]-的ILs中催化效果最佳，在所選[Omim][PF6]、[Hmim][PF6]、[Dmim][PF6]、[Bmim][PF6]介質(zhì)中，底物的轉(zhuǎn)化率均在95%以上；CPL在常用有機(jī)溶劑正己烷中循環(huán)使用4次后，其活性低于50%，而在ILs中循環(huán)使用15次后，CPL的催化活性仍在90%之上。

3.3 ILs中纖維素酶催化反應(yīng)

纖維素是一種廉價的綠色材料，其世界產(chǎn)量每年近 2 200億噸，在化石能源短缺的今天受到人們格外的重視，具有重要的研究意義[44]。纖維素的聚合度較高，且分子內(nèi)和分子間皆存在大量的氫鍵，致使其在常規(guī)有機(jī)溶劑中的溶解度很低，尋找一種可高效溶解纖維素的綠色溶劑成為研究的熱點(diǎn)[45]。

2002年，Swatloski[46]著文介紹纖維素可以穩(wěn)定的溶解于ILs 1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim][Cl])。自此，ILs的應(yīng)用拓展到纖維素領(lǐng)域，并且逐步在生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與分離中得到運(yùn)用，為生物質(zhì)能源的開發(fā)和利用開拓了一條新的路徑[47-49]。

Shen等[50]在ILs [Emim][Ac]/N-甲基吡咯烷酮兩相體系中研究了纖維素酶和纖維二糖酶水解玉米秸稈中的纖維素，在140 ℃的油浴中進(jìn)行催化反應(yīng)，經(jīng)過24 h，葡萄糖的產(chǎn)率高達(dá)60.8%。

范琳等[51]分別研究了ILs 1-乙基-3-甲基咪唑醋酸([Emim][Ac])、1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯([Emim][DEP])對纖維素酶溶解微晶纖維素的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ACE超聲化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)的輔助下，[Emim][Ac]、[Emim][DEP]對溶解的促進(jìn)作用效果明顯，使纖維素的結(jié)晶度降到62.3%、53.6%；ILs的最佳投入量為0.5%，此時纖維素水解程度最大，纖維素酶的酶解率分別提高17.5%、11.4%，且使得纖維素酶體系中的β-葡萄糖苷酶催化活性分別提高了87%、120%。

朱長輝等[52]在ILs [Emim][Ac]/水(體積比4∶1)的雙體系中，探討了纖維素酶、纖維二糖酶協(xié)同作用對催化纖維素成糖的影響。發(fā)現(xiàn)兩種酶協(xié)同作用下可有效提高纖維素還原成糖的產(chǎn)率，當(dāng)反應(yīng)72 h時，還原糖和葡萄糖的產(chǎn)率分別達(dá)86.5%、35.2%，且隨著時間的增長兩種糖的產(chǎn)量仍在持續(xù)增加。

耿秀娟等[53]討論了利用ILs([Bmim][Cl])/堿溶液(NaOH)雙體系預(yù)處理麥草秸稈對酶水解成糖的影響。將[Bmim][Cl]/NaOH雙體系預(yù)處理風(fēng)干麥草秸稈與單獨(dú)NaOH預(yù)處理風(fēng)干麥草秸稈進(jìn)行對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者預(yù)處理過的麥草秸稈的酶解率高達(dá)95.3%，比后者高24.6%，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為ILs處理工藝和堿處理工藝的結(jié)合運(yùn)用提供了有價值的參考。

3.4 ILs中氧化還原酶催化反應(yīng)

氧化還原酶在含ILs介質(zhì)的酶催化反應(yīng)中，主要用于合成手性化合物，該催化過程常需輔酶(價格昂貴)的參與，所以為了降低成本，常用完整的細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)。該酶的活性受ILs濃度的影響，一般情況下，隨著ILs濃度的升高，酶的活性隨之降低[54]。

2002年，Budde等[55]首次介紹了大豆過氧化酶、辣根過氧化酶等幾種氧化酶在ILs介質(zhì)中存在一定的催化活性。同年，Laszlo等[56]用微過氧化酶、血晶素過氧化物酶、細(xì)胞色素c過氧化物酶分別在ILs [Omim][PF6]、[Bmim][PF6]、[Bmim][(CF3SO2)2N]中催化鄰甲氧基苯酚(以微過氧化酶為例，圖9)，與在常用有機(jī)溶劑二甲基亞砜、甲醇中的催化相比，三種酶的催化活性大大提高。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了氧化還原酶可在ILs中實(shí)現(xiàn)酶催化。

圖9 在[Omim][PF6]中微過氧化酶催化鄰甲氧基苯酚聚合

Eckstein等[57]介紹了在[Bmim][(CF3SO2)2N] /緩沖液雙體系中利用脫氫還原酶催化2-辛酮的還原反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)酶在該雙體系中的穩(wěn)定性和催化速率明顯高于有機(jī)溶劑(甲基叔丁基醚)/緩沖液雙體系，且大幅地減少了副產(chǎn)物的產(chǎn)生，使轉(zhuǎn)化率近100%。

劉洋洋等[58]研究了ILs [Bmim][Cl]對釀酒酵母的乙醛脫氫酶活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，[Bmim][Cl]的濃度在0.001～2.000 mg/mL之間，酶活性隨[Bmim][Cl]濃度的增加而提高；當(dāng)[Bmim][Cl]的濃度大于2.000 mg/mL時，酶活性受到抑制，且濃度越高，受抑制影響越嚴(yán)重。

Choi等[59]在ILs [Bmim][NTf2]/水兩相體系中，研究了枯草桿菌葡萄糖脫氫酶、酵母還原酶(YOL151W)和透性化大腸桿菌細(xì)胞三者協(xié)同催化還原3-氯-1-苯基-1-丙酮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ILs的存在下，基質(zhì)的溶解度大大提高，且左旋型目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率在99%以上。

4 結(jié)論

雖然ILs以其結(jié)構(gòu)可設(shè)計、極性可調(diào)等獨(dú)特的性質(zhì)，在酶催化領(lǐng)域的應(yīng)用受到相關(guān)學(xué)者們的重點(diǎn)關(guān)注，取得了多項喜人的成果，但就目前研究現(xiàn)狀而言，仍存在很多不足之處有待解決：

1) ILs對酶分子活性影響的機(jī)理研究比較模糊，ILs對酶結(jié)構(gòu)的影響因素仍需進(jìn)一步明確；

2) ILs的種類雖多，但相關(guān)數(shù)據(jù)仍不健全，例如“溶度參數(shù)、極性分?jǐn)?shù)”等，難以根據(jù)數(shù)據(jù)庫找到最適合的ILs進(jìn)行酶催化；

3) 對ILs極性的準(zhǔn)確判斷和酶分子之間的關(guān)系尚不明確；

4) 酶催化合成產(chǎn)物后，ILs和酶的有效回收問題有待深入研究。

隨著合成技術(shù)的不斷發(fā)展，制備出新型、成本低、更加高效環(huán)保的ILs，將會在酶催化領(lǐng)域得到大規(guī)模應(yīng)用；且隨著人們對酶催化研究的不斷深入，探尋出既能發(fā)揮酶在ILs中的高效催化活性，又能兼具酶在ILs中溶解性和穩(wěn)定性的方法也會在未來有所突破。

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