花生芽中6-芐基腺嘌呤的測定方法研究

建立了高效液相色譜法測定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的方法。6-芐基腺嘌呤的檢測波長為267nm；流動相為甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液（50∶50，v/v）；前處理的提取方式為超聲波提取法；高效液相色譜法測定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的在1-50mg/L范圍線性良好，相關系數(shù)為0.9998，檢出限為0.1mg/kg，精密度為1.82%，用該方法測定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的回收率在90%以上。

6-芐基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)分子式是C12H11N5，分子量為225.25，熔點：230℃，形狀為白色晶體，難溶于水，微溶于乙醇等有機溶劑，易溶于酸和堿且性質穩(wěn)定。6-芐基腺嘌呤是一種人工合成的細胞分裂素，主要用于促進細胞分裂、細胞增大、種子發(fā)芽和果實生長等，我國曾經(jīng)允許在豆芽生產(chǎn)上的應用。6-芐基腺嘌呤作為植物生長調(diào)節(jié)劑，其安全性目前沒有結論，并且缺乏食品添加劑工藝必要性，目前我國的標準GB2760已經(jīng)禁止6-芐基腺嘌呤作為食品用加工助劑生產(chǎn)經(jīng)營和使用。

6-芐基腺嘌呤更多的報道是關于在豆芽生產(chǎn)中的應用，俗稱的“無根粉”主要成分就是6-芐基腺嘌呤，對于花生芽不管是生產(chǎn)方面或者是檢測方面報道較少。花生芽被認為一種食療兼?zhèn)涞氖称?，營養(yǎng)豐富，并富含維生素及各種氨基酸和微量元素，花生芽的生產(chǎn)和銷售越來越普遍，對花生芽的各項指標的檢測方法有研究的意義。

6-芐基腺嘌呤的檢測方法主要是光譜法和色譜法，光譜法靈敏度不夠，基質干擾大，色譜法具有準確、高效、快速的特點。本論文研究高效液相色譜法測定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的方法，為花生芽中6-芐基腺嘌呤的檢測提供技術參數(shù)。

材料與方法

儀器及材料 高效液相色譜儀：LC20AD（日本島津公司）；色譜柱：C18柱(250mm×4.6μm，美國waters公司)；電子分析天平（日本島津公司）；微波爐（美的公司）；離心機（sigma公司）；超純水系統(tǒng)（德國Millipore公司）；刀片式均質器（德國ⅠKA公司）；超聲波提取器（上海比朗）。

6-芐基腺嘌呤標準品純度均大于99%（德國Dr.Erenstorfer公司）；甲醇（色譜純，美國CNW公司）；乙酸銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

儀器條件 流動相：甲醇：20mmol/L乙酸銨溶液（50∶50，v/v），等度洗脫。流速：1.0mL/min；色譜柱溫度：40℃；檢測器：二極管陣列檢測器，波長267nm；進樣量：20μL。

結果與討論

檢測波長的確定 二極管陣列檢測器能從190nm到900nm的全波段檢測，要檢測6-芐基腺嘌呤首先要確定其檢測波長。配制6-芐基腺嘌呤的標準溶液，濃度為10.0mg/L，上機測定，從測定結果的光譜色譜三維圖發(fā)現(xiàn)在5.8分鐘有明顯的響應，提取該時間點的吸收光譜圖，結果見圖1。

圖1 6-芐基腺嘌呤的吸收光譜圖

圖1 中發(fā)現(xiàn)在210nm及267nm處均有吸收頂點，210nm處受到的干擾較大，因此選擇267nm為6-芐基腺嘌呤的檢測波長。

流動相的選擇 選擇純甲醇、甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液（50∶50，v/v）和甲醇-水（50∶50，v/v）三種不同體系的流動相作比較，流速均為為1.0mL/min，進樣濃度為1.0mg/L的6-芐基腺嘌呤標準溶液，結果見圖2。

圖2 不同甲醇比例作為流動相的峰面積變化圖

從圖2中，1號為純甲醇流動相的色譜圖，峰形不對稱，出峰時間過早有可能與其他雜質重合或者分離不好；3號為甲醇-水（50∶50，v/v）流動相的色譜圖，峰形對稱但是峰展寬較大；2號為甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液（50∶50，v/v）流動相的色譜圖，峰形對稱并且峰展寬小，乙酸銨在流動相中有改善峰形的作用，因此選擇甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液（50∶50，v/v）作為測定6-芐基腺嘌呤的流動相。

樣品前處理 用甲醇提取花生芽中的6-芐基腺嘌呤，比較幾種不同的提取方式，花生芽直接稱樣20.0g置于100mL的離心管中，加入50mL甲醇，用刀片式均質器均質2分鐘。超聲波提?。河贸暡ㄌ崛∑魈崛?0min；浸泡提?。涸谑覝叵路胖?0小時；微波提?。何⒉ㄌ崛?分鐘；各方法提取結束后冷卻，5000r/min離心10分鐘，取上層溶液過0.45μm濾膜，上機測定，結果見表1。表中微波提取法雖然用時少，但是結果偏低，可能的原因是提取時間不足或者是6-芐基腺嘌呤分解了，超聲波提取效率高，因此選擇超聲波提取法提取花生芽中的6-芐基腺嘌呤。

表1 花生芽加標提取6-芐基腺嘌呤結果

方法學驗證 線性關系及檢出限 配制6-芐基腺嘌呤的系列標準溶液，上機測定，高效液相色譜法6-芐基腺嘌呤在1-50mg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關系，相關系數(shù)為0.9998，以基線噪聲的三倍作為測定的檢出限，6-芐基腺嘌呤的檢出限為0.1mg/kg。

表2 6-芐基腺嘌呤線性及檢出限

精密度及回收率 進樣10.0mg/L的6-芐基腺嘌呤標準溶液，連續(xù)進樣11次計算精密度，結果見表4，高效液相色譜法測定6-芐基腺嘌呤的精密度為1.82%，精密度符合測定的要求。

表3 6-芐基腺嘌呤精密度

取花生芽樣品，稱樣20.0g，添加6-芐基腺嘌呤標準溶液作為回收率的測試，按照3.3的前處理方法處理花生芽樣品，回收率實驗結果見表4。高效液相色譜法測定6-芐基腺嘌呤的回收率在90%以上，滿足分析要求。

表4 6-芐基腺嘌呤的回收率

建立了高效液相色譜法測定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的方法。通過提純光譜，確定選擇267nm為6-芐基腺嘌呤的檢測波長；通過比較，選擇甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液（50∶50，v/v）作為檢測6-芐基腺嘌呤的流動相，流動加入乙酸銨能夠很好地改善峰形；研究了前處理的提取方式，選擇超聲波提取法提取花生芽中的6-芐基腺嘌呤；對方法進行驗證，高效液相色譜法測定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的在1-50mg/L范圍線性良好，相關系數(shù)為0.9998，檢出限為0.1mg/kg，精密度為1.82%，用該方法測定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的回收率在90%以上。高效液相色譜法測定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的方法準確，高效，可滿足檢測技術要求。

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