胡 俊,湯 斌，李 松

(安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖 241000)

抗菌肽是一種常見的生物拮抗劑，主要表現(xiàn)為對(duì)一些G+細(xì)菌(特別是一些致病菌，如金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等)具有一定的拮抗作用[1]，因而在環(huán)境保護(hù)、醫(yī)療衛(wèi)生和食品加工等眾多領(lǐng)域都有著較為重要的應(yīng)用．利用微生物生產(chǎn)抗菌肽具有生產(chǎn)周期短，產(chǎn)物易分離純化等優(yōu)點(diǎn)[2]，是工業(yè)上抗菌肽的主要獲得途徑．

抗菌肽純化方法主要包括膜分離、電泳分離、層析技術(shù)以及高效液相色譜分離等[3]．在利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)發(fā)酵液中的抗菌肽組分進(jìn)行分離時(shí)，需要先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，以降低分離體系中的蛋白豐度、分離難度以及避免造成儀器損壞．從目前的研究現(xiàn)狀來看，預(yù)處理方式主要包括鹽析、色譜柱粗分離、分級(jí)沉淀和有機(jī)萃取等[4]．胡瑞萍[5]等采用鹽酸沉淀和Sephadex G-50 凝膠柱分離對(duì)枯草芽孢桿菌BSD-2抗菌肽進(jìn)行了粗提?。粍㈧o[6]等在枯草芽孢桿菌抗菌肽分離純化過程中，采用陰離子交換柱DEAE-Sepharose FF等方式對(duì)發(fā)酵粗提液進(jìn)行預(yù)處理；劉穎[7]等在分離抗真菌肽的過程中，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度以及利用丙酮分級(jí)沉淀等方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行了粗提．由于抗菌肽具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性較高且在有機(jī)溶劑和水中都具有一定的溶解性等特點(diǎn)[8]，所以，利用合適的有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)酵液中的抗菌肽進(jìn)行萃取可使其中大多數(shù)雜蛋白變性沉淀，而分子量較小的多肽類物質(zhì)可部分轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中．相比其他的預(yù)處理方式，此方法操作簡(jiǎn)單且能取得較好的預(yù)處理效果，使后續(xù)HPLC分離過程簡(jiǎn)化，因而以此作為發(fā)酵液的預(yù)處理方法．

研究以地衣芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株時(shí)，發(fā)酵液預(yù)處理操作過程中的各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)抗菌肽的萃取效果和相對(duì)應(yīng)的反萃取效果的影響，以及最佳萃取試劑、萃取和反萃取條件的確定，最終通過蛋白豐度檢測(cè)對(duì)預(yù)處理效果進(jìn)行了評(píng)估．相比其他預(yù)處理方式，此方法操作簡(jiǎn)單且能較好地達(dá)到預(yù)處理效果，使后續(xù)HPLC分離過程簡(jiǎn)化，因而選擇此方法作為發(fā)酵液的預(yù)處理方法．

1 實(shí)驗(yàn)材料

(1)菌種.地衣芽孢桿菌BL32、金黃色葡萄球菌AS1.2465(以上菌株均為安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵工程研究中心實(shí)驗(yàn)室篩選保藏)．

(2)試劑與儀器.試劑:氨芐青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)品(160 萬U/g，純度≥99.9%)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、95%乙醇、氯仿(AR)、正丁醇(AR)、異戊醇(AR)、硫酸鎂(AR)、碳酸鈣(AR)、可溶性淀粉、胰蛋白胨、酵母粉(以上藥品均購自國(guó)藥集團(tuán)公司)以及市售豆粕．

儀器：NS4201二元分析液相色譜系統(tǒng)、RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FD8-3冷凍干燥機(jī)、電熱鼓風(fēng)式干燥箱．

(3)培養(yǎng)基.LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂粉1.5%；種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%，豆粕2%，硫酸鎂0.02%，碳酸鈣0.05%．

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 發(fā)酵液的獲得

(1)種子液制備.用接種環(huán)從斜面菌種保藏管中挑取菌體接種于20 mL種子培養(yǎng)基中，于37 ℃環(huán)境中200 r/min震蕩培養(yǎng)18 h備用．

(2)發(fā)酵液的獲取.配制上述發(fā)酵培養(yǎng)基并加入10 L發(fā)酵罐(BIOTECH-10JS-9000C，上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中進(jìn)行實(shí)罐滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至室溫時(shí)接入2%的地衣芽孢桿菌種子液．控制發(fā)酵條件為37 ℃、溶氧30%(串聯(lián)轉(zhuǎn)速)，發(fā)酵過程中恒定pH 6.5(10% 氨水調(diào)節(jié))，發(fā)酵時(shí)間為30 h．發(fā)酵結(jié)束后[9]，將發(fā)酵液進(jìn)行8 000 r/min離心10 min，取上清液備用．

2.2 抗菌效價(jià)與抗菌肽相對(duì)含量計(jì)算方法

(1)抗菌實(shí)驗(yàn)方法.抗菌實(shí)驗(yàn)方法采取瓊脂表面擴(kuò)散法[10]．在LB平板表面涂布指示菌，同時(shí)在培養(yǎng)基表面放置牛津杯(規(guī)格：內(nèi)徑φ=8 mm)．向牛津杯中加入100 μL待測(cè)液，平板置于一定的條件下培養(yǎng)，后測(cè)定牛津杯周圍的抑菌圈直徑大?。?/p>

(2)抗菌效價(jià)計(jì)算方法.準(zhǔn)確稱取氨芐青霉素鈉1.000 g，利用超純水配制濃度為1.000 g/mL(160 萬抗菌單位)的氨芐青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[11]，對(duì)此標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行梯度稀釋分別配制2～20 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用．取一定量的樣液置入無菌EP管中用無菌水梯度稀釋5～15倍，經(jīng)0.22 μm的無菌過濾器過濾后按2.2(1)的方法進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)．樣液抑菌效價(jià)的測(cè)定采用國(guó)際上通用的抗生素效價(jià)測(cè)定方法“杯碟法”中的二計(jì)量法[12]．即根據(jù)下列公式和抑菌圈的大小得出相應(yīng)的抗菌效價(jià)．

(3)抗菌肽相對(duì)含量的測(cè)定方法.根據(jù)樣液中抗菌物質(zhì)的含量與其抗菌效價(jià)成正比的關(guān)系，樣液中抗菌肽的相對(duì)含量主要是通過測(cè)定抑菌效價(jià)的方式體現(xiàn)的．發(fā)酵液中抗菌肽相對(duì)含量直接通過原發(fā)酵液的抗菌效價(jià)判斷，萃取操作后溶于有機(jī)溶劑和超純水中的抗菌肽相對(duì)含量測(cè)定方法如下：10 000 r/min離心5 min，收集有機(jī)相或水相，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后60 ℃烘干，溶質(zhì)利用5 mL超純水重新溶解后經(jīng)0.22 μm水膜過濾．按2.2(2)所述方法測(cè)定溶解液抗菌效價(jià)．

2.3 發(fā)酵液中抗菌肽萃取條件的研究

(1)不同有機(jī)溶劑對(duì)萃取效率的影響.分別以氯仿、四氯化碳、正丁醇、異戊醇和混合醇(正丁醇∶異戊醇=1∶1)為萃取用的有機(jī)萃取劑．將有機(jī)溶劑與原發(fā)酵液上清液按體積比1∶1混合進(jìn)行萃取操作．分別收集有機(jī)相和發(fā)酵液并對(duì)其中抗菌肽的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定．每種有機(jī)溶劑設(shè)3個(gè)平行組，抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值．

(2)萃取機(jī)溶劑/發(fā)酵清液的體積比對(duì)萃取效率的影響.控制有機(jī)溶劑與發(fā)酵清液的體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1進(jìn)行萃取，測(cè)定有機(jī)相和水相中的抗菌肽相對(duì)含量．各體積比設(shè)3個(gè)平行組，抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值．

(3)萃取溫度對(duì)萃取效率的影響.取適量的有機(jī)溶劑和發(fā)酵上清液分別置入水浴鍋中保溫30 min，水浴鍋的溫度分別設(shè)置為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃和65 ℃．后迅速將有機(jī)溶劑與培養(yǎng)液清液按合適的體積比混合，分別收集有機(jī)相和發(fā)酵液，對(duì)兩者溶解的抗菌肽相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定．各溫度條件下設(shè)3個(gè)平行組，抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值．

2.4 反萃取條件的研究

反萃取是指在萃取操作以后，將溶解有抗菌肽的有機(jī)溶劑與超純水混合，使得有機(jī)溶劑中部分抗菌肽轉(zhuǎn)移至水相的實(shí)驗(yàn)過程，目的是為了進(jìn)一步降低待分離體系中的蛋白豐度．

(1)有機(jī)相/超純水體積比對(duì)反萃取效果的影響.分別設(shè)置反萃取過程中 V有機(jī)相/V超純水比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，在常溫下充分震蕩混合均勻，按2.2(2)方法對(duì)各組有機(jī)相以及水相中的抗菌肽相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定．各體積比設(shè)3個(gè)平行組，抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值．

(2)溫度對(duì)反萃取效果的影響.取適量的有機(jī)溶劑和超純水分別置于溫度設(shè)置為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃水浴鍋中保溫30 min后迅速將有機(jī)溶劑與超純水按合適的體積比混合，測(cè)定各組有機(jī)溶劑和水相中抗菌肽的相對(duì)含量．各溫度條件下設(shè)3個(gè)平行組，抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值．

(3)反萃取操作次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果的影響.在最適操作溫度條件下，按最適體積比將含有抗菌肽的有機(jī)溶劑與超純水進(jìn)行混合，充分震蕩后離心．收集上層有機(jī)相再一次按體積比加入超純水重復(fù)上述操作2至5次，分別對(duì)每次有機(jī)相中剩余的抗菌肽相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定．各操作次數(shù)設(shè)3個(gè)平行組，抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值．

2.5 蛋白豐度的檢測(cè)

分別取發(fā)酵濃縮液、萃取操作后溶有抗菌肽的有機(jī)溶劑以及反萃取后溶有抗菌肽的水溶液經(jīng)0.45 μm膜過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析．色譜檢測(cè)條件分別為柱型C18柱(規(guī)格：250×8 mm)，操作溫度25 ℃；有機(jī)相(A相)為乙腈(色譜純)；非有機(jī)相(B相)為超純水；A相由起始濃度30%上升至結(jié)束濃度60%;檢測(cè)光波長(zhǎng)254 nm;分離時(shí)間30 min;進(jìn)液量20 μL．

3 結(jié)果與分析

3.1 萃取實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

不同有機(jī)溶劑萃取液的萃取效率和抑菌效果如圖1、圖2所示.由圖2可知，以正丁醇為萃取溶劑時(shí)形成的抑菌圈的直徑較大即以正丁醇為有機(jī)溶劑時(shí),發(fā)酵液中的抗菌肽可較多的轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，其萃取率為33.14%.其次為混合醇，萃取效果最差的為四氯化碳，其對(duì)抗菌肽的萃取率僅有8.28%.

V有機(jī)溶劑/V發(fā)酵液對(duì)萃取效果的影響如圖3所示.溫度對(duì)萃取效果的影響如圖4所示.由圖3可知，萃取過程中，不同的有機(jī)相與發(fā)酵液的體積比對(duì)萃取效果有一定的影響，其中設(shè)定V有機(jī)相/V發(fā)酵液為2∶1時(shí)，抗菌肽的萃取相比于V有機(jī)相/V發(fā)酵液為1∶1提高了8.53%．但之后有機(jī)溶劑量繼續(xù)增加時(shí)，萃取率上升并不明顯．同時(shí)由圖4可得操作溫度大于45 ℃時(shí)，萃取率趨于穩(wěn)定，但相對(duì)于室溫條件下提高了4.5%左右．

由以上優(yōu)化的數(shù)據(jù)分析可得出，在發(fā)酵液的萃取預(yù)處理的過程中，以正丁醇為萃取試劑，最佳效益的萃取條件V有機(jī)相/V發(fā)酵液為2∶1，萃取溫度為45 ℃．

圖1 有機(jī)溶劑對(duì)抗菌肽的萃取效率圖2 不同有機(jī)溶劑萃取液的抑菌效果

圖3 V有機(jī)溶劑/V發(fā)酵液對(duì)萃取效果的影響圖4 溫度對(duì)萃取效果的影響

3.2 反萃取條件優(yōu)化

不同的V有機(jī)相/V超純水對(duì)反萃取效果的影響如圖5所示.不同溫度對(duì)反萃取效果的影響如圖6所示.有機(jī)相中殘留抗菌效價(jià)與反萃取次數(shù)的關(guān)系如圖7所示.由圖5、圖6、圖7可知，在實(shí)驗(yàn)操作中不同的V有機(jī)相/V超純水對(duì)反萃取的效果沒有較為顯著影響；相對(duì)于室溫環(huán)境，設(shè)定反萃取操作溫度為45 ℃時(shí)，單次反萃取率有所提高．而在最適反萃取條件下進(jìn)行重復(fù)操作，進(jìn)行2次反萃取時(shí)，反萃取率相對(duì)于單次操作提高了7.84%．因此，在反萃取操作中，設(shè)定V有機(jī)相/V超純水為1∶1、操作溫度為45 ℃、操作次數(shù)為2次時(shí)可獲得較好的反萃取效益，反萃取率接近61.28%．

圖5 不同的V有機(jī)相/V超純水對(duì)反萃取效果的影響圖6 不同溫度對(duì)反萃取效果的影響

圖7 有機(jī)相中殘留抗菌效價(jià)與反萃取次數(shù)的關(guān)系

圖8 原發(fā)酵液蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果

3.3 蛋白豐度的檢測(cè)結(jié)果分析

原發(fā)酵液樣品色譜檢測(cè)結(jié)果如圖8所示.由高效液相色譜檢測(cè)數(shù)據(jù)可以看出，在原發(fā)酵液樣品圖譜中出現(xiàn)峰數(shù)目較多，可見原發(fā)酵液中蛋白豐度較大，在此基礎(chǔ)上很難直接對(duì)抗菌肽進(jìn)行分離收集．但經(jīng)過有機(jī)萃取操作后，對(duì)比原發(fā)酵液的檢測(cè)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，圖譜中峰數(shù)目明顯下降及大部分的雜蛋白組分可在正丁醇的作用下變性沉淀，繼而被除去(見圖9)．進(jìn)一步經(jīng)過反萃取操作，對(duì)比圖9可知，分離時(shí)間大于6.5 min出現(xiàn)的蛋白組分在水相中溶解度較小并被截留在有機(jī)相中，水相的蛋白組分明顯下降(見圖10)．因此通過以上兩步的操作，使得最終待分離體系中的蛋白組成相對(duì)簡(jiǎn)單，從而達(dá)到了較為理想的處理效果．

圖9 萃取操作后溶于有機(jī)相蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果

圖10 反萃取操作后溶于水相蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

有機(jī)萃取是抗菌肽純化工藝中發(fā)酵液的預(yù)處理方法，相比與其他方法具有高效簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)．以正丁醇為有機(jī)萃取劑，在合適的V有機(jī)相/V發(fā)酵液和操作溫度條件下，可使地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中抗菌肽最大限度地轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，然后進(jìn)一步進(jìn)行反萃取操作，對(duì)影響其效果的操作溫度和反萃取操作次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化．在45 ℃條件下，二次反萃取率接近61.28%，萃取操作可使發(fā)酵液中大多數(shù)雜蛋白組分被除去，使得后期高效液相色譜的分離工作難度大大降低，從而起到了相應(yīng)的預(yù)處理效果．

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