聚藥雄蕊植物甜葉菊花部特征與繁育特性初步研究

袁鎏柳，羅慶云，陳思銳，楊凱祺，麥雅文

（南京農業(yè)大學園藝學院中藥材科學系，南京210095）

兩性花植物作為優(yōu)勢種群，既可通過柱頭接受外來花粉與胚珠生產種子（雌性功能），又可散發(fā)花粉與其它胚珠形成種子而實現(xiàn)雄性功能。兩性花形態(tài)結構及雌、雄蕊相對位置隨發(fā)育進程的動態(tài)變化會直接影響植株雌性和雄性功能的有效發(fā)揮[1-4]。

聚藥雄蕊是花藥環(huán)繞花柱成筒狀聚合而花絲分離的一種雄蕊合生現(xiàn)象，廣泛存在于菊科、堇菜科、蛇菰科、香茜科、鳳仙花科等植物的兩性花中[5]。為揭示聚藥雄蕊對兩性花植物雌性和雄性功能的貢獻途徑，了解其繁殖適應意義，同時為甜葉菊種質遺傳創(chuàng)制途徑的建立提供參考，本文以甜葉菊為例，對聚藥雄蕊植物花部特征及繁育特性進行了初步研究。

1 研究材料與地點

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）為菊科斯特維亞屬多年生草本植物，自然分布于南美洲巴西巴拉圭平原[6]，為上世紀60年代起開始人工種植研究的新型甜味劑作物，我國自上世紀70年代后半開始引入，目前已發(fā)展為種植面積、提取加工量及出口量最大的國家[7-8]。甜葉菊為多年生叢生型半灌木草本植物，可以匍匐的莖節(jié)、種子等進行繁殖，莖末端直立，葉對（互、輪）生?；ü谠?—11月，盛花、果期在8—10月。

套袋自交、不同發(fā)育時期柱頭及花藥發(fā)育動態(tài)變化情況研究用材料為本實驗室搜集和創(chuàng)制的部分種質資源共350份，分別種植于江蘇省南京市玄武區(qū)孝陵衛(wèi)街道的南京農業(yè)大學本部校區(qū)種植圃和江蘇省南京市江浦縣的南京農業(yè)大學園藝試驗站中；隔離種植實驗用材料為無性扦插繁殖的譜星3號，種植地點為位于江蘇省南京市六合區(qū)竹鎮(zhèn)鎮(zhèn)金磁社區(qū)江蘇省農業(yè)科學研究院試驗站中。甜葉菊授粉生物調查地點為前述種植圃、園藝試驗站和江蘇省鹽城市東臺縣三倉鎮(zhèn)甜葉菊產地。

2 研究方法

2.1 花部特征與傳粉生物學觀察

2017年7月，甜葉菊開始進入盛花期前。選擇有代表性5個株系進行如下觀察：頭狀花序發(fā)育進程、小花構造、小花開花進程、花冠顏色等。每個株系選取發(fā)育進程一致的頭狀花序30個進行標記并定點觀測，每天9:00～11:00和15:00～16:00各觀察1次，直到花朵萎蔫。小花開放前記錄花冠筒長度、花冠筒顏色、小花開放時間；小花開放后記錄柱頭伸長情況、授粉生物訪花情況、柱頭和花瓣萎蔫情況等。

在甜葉菊頭狀花序發(fā)育過程中，總苞片最先形成，然后小花再開始伸長，從總苞片形成至小花開放，因品系和氣溫而異，大概需要15～25d，小花開放時間為4～5d。為便于交流，開放前根據小花與總苞片的相對高度劃分為4個發(fā)育時期，開放后依照小花開放時間劃分為3個發(fā)育時期，共7個發(fā)育時期：1/4高期（小花約為總苞片高度1/4）、1/2高期（小花約為總苞片高度1/2）、3/4高期（小花約為總苞片高度3/4）、等高期（小花與總苞片等高）、初花期（花開第1天）、盛花期（花開第2～5d）和花后期（花后5d及以后，柱頭和花冠萎蔫）。每個時期選取10朵小花進行顯微解剖，在顯微鏡下分析雌、雄蕊相對位置及其隨發(fā)育時間的變化并統(tǒng)計每朵小花花粉數(shù)量等。參照龔燕兵和黃雙全方法[9]，在晴天上、下午進行訪花昆蟲觀察。對訪花昆蟲的類型與訪花行為、訪花頻率、花間運動等進行分析，判斷甜葉菊常見訪花昆蟲和有效傳粉者。

2.2 繁育特性

2.2.1 異交指數(shù) 通過小花開放口徑、雌雄蕊空間位置及成熟同步情況等進行繁育系統(tǒng)評判。具體方法為：(1)小花開放口徑＜1mm者記為0，1～2mm者記為1，＞2、≤6mm者記為2，＞6mm者記為3；(2)花藥開裂時間與柱頭可授期之間時間間隔，雌雄蕊同時成熟或雌蕊先熟者記為0，雄蕊先熟者記為1；(3)柱頭與花藥的空間位置，同一高度者記為0，空間分離者記為1。三者之和為異交指數(shù)，異交指數(shù)越大，植物異交程度越高，對外界傳粉者依賴性越強[10]。

2.2.2 花粉胚珠比 取等高期小花，用鑷子尖端將花冠筒剖開，將花藥筒連同其包裹的雌蕊一同取出，統(tǒng)計花藥個數(shù)后置于2．0mL離心管中，按每只花藥20μL加入蒸餾水，用移液器攪拌勻漿使花藥中的花粉完全釋放，制成花粉懸浮液。取4μL懸浮液在光學顯微鏡下統(tǒng)計花粉數(shù)，重復5次。

用解剖刀劃開子房，鏡檢統(tǒng)計胚珠數(shù)。花粉數(shù)量與胚珠數(shù)量之比即為花粉胚珠比（P/O比）。較高的P/O值代表異交程度較高，較低的P/O值則表示植物以自交為主[11]。

2.2.3 花粉活力和柱頭活性 取2．1所列7個發(fā)育時期（1/4高期、1/2高期、3/4高期、等高期、初花期、盛花期、花后期）花藥，參照劉巧紅等方法[12]，用含15%（m:v）蔗糖的花粉管萌發(fā)液室溫下萌發(fā)處理4h[13]，光學顯微鏡下統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，根據花粉萌發(fā)率判斷花粉活力。

聯(lián)苯胺—過氧化氫法測柱頭可授性（King，1960）[14]：將不同時期柱頭置載玻片上，滴加聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液[1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22（v:v:v）]，顯微鏡下鏡檢，若柱頭周圍反應液呈藍色，根據氣泡多少判斷柱頭可授性強弱。

2.2.4 人工授粉套袋實驗 為揭示甜葉菊是否存在自發(fā)自交現(xiàn)象，以及自交親和性程度，設置了以下幾個套袋處理實驗：1）直接套袋：去除已開放花序，保留未開放者，直接套袋；2）人工自交授粉：花蕾套袋，剝取同植株等高期小花花藥筒將其花粉涂抹于盛花期柱頭上，然后套袋；3）人工異交授粉：花蕾套袋，等高期去雄，盛花期涂抹適量其他甜葉菊株系花粉，之后套袋。每處理30朵小花。果實成熟后統(tǒng)計結實率，并與自然狀態(tài)下對應的指標進行比較[3]。

2.2.5 隔離種植實驗 由于甜葉菊的訪花昆蟲之一蜜蜂的有效活動范圍可達2～3km，最遠可達14km，為進一步驗證甜葉菊是否自交不結實，特選擇周圍20km范圍內無甜葉菊種植的地塊，以扦插繁殖的同一品系植株300棵為材料，進行天然隔離種植實驗。同時設置人工異交授粉對照試驗，正反交各處理30朵小花。果實成熟后統(tǒng)計比較結實率。

2.3 數(shù)據分析

采用SPSS20．0 for Windows統(tǒng)計軟件中One-way ANOVA分析套袋隔離種植實驗中不同處理間的結實率差異。數(shù)據間的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗法（S-N-K法）。

3 結果

3.1 花部綜合特征

甜葉菊頭狀花序筒狀，簇生于傘房狀分枝頂端，長 6．5±0．2mm，由聚生于直徑為 1．3±0．1mm 花盤上的 5（稀6）朵的小花組成；花萼異變?yōu)閯偯珷罟诿豢偘?（稀4），位于頭狀花序外圍，圓筒狀，綠色，近等長，彼此交叉重疊，外密被短柔毛。

小花基部白色或淺紅色聯(lián)合成筒狀，先端白色，5裂，喇叭口狀外展 （圖1-V/A），單花壽命4～5d，花冠筒外被稀疏柔毛。雄蕊5（稀6），全著藥，花藥完全合生形成花藥筒，長1．6±0．3mm，花藥管頂端有小口（圖1-V/A）。雄蕊花絲分離，著生于花托。柱頭2（稀3）裂，花柱和柱頭裂片外側表面分布有腺體，功能未明（圖1-V/C，圖3）。柱頭和花柱上端被包裹在花藥筒內，形成類似合蕊柱的柱狀結構。在開花后第2天，柱頭從花藥筒頂端小口伸出，呈“Y”型張開，直至萎蔫（圖1-VI/B&C）。

圖1 甜葉菊花器官形態(tài)發(fā)育進程Fig.1 Floral organ morphogenesis of S.rebaudiana

3.2 傳粉生物學

傳粉生物學觀測發(fā)現(xiàn)，蜜蜂經常前來采集花粉，也常發(fā)現(xiàn)薊馬經從花冠筒口處進入小花內取食花粉，偶有蝴蝶探入花冠筒內吸食花蜜。以蜜蜂和薊馬的訪問頻率最高，蝴蝶的訪問頻率最低。

薊馬是被觀察到訪問時間最長、最頻繁的甜葉菊訪花者，其生活在開放的小花中，直至花粉連同花粉囊被取食完畢。由于田間正常生長的甜葉菊植株小花多，單株花期持續(xù)時間長，對于主要依靠爬行移動的小型昆蟲薊馬來說，活動空間足夠大，花粉量足夠多，為此，對同一只薊馬，其活動范圍多只局限于同一植株不同小花之間。雖然，在肉眼及顯微鏡下可見薊馬身上花粉附著明顯，也常觀察到薊馬在小花之間來回穿梭活動，但由于薊馬活動范圍小，且以取食花粉為主，為此，對甜葉菊花粉外傳（雄性功能）不利。

蜜蜂是另一類甜葉菊常見訪花者，以采集花粉為主，在盛花期，一只蜜蜂大概只需20min左右就可以采集滿兩攜粉足，表明花粉是蜜蜂訪問甜葉菊花朵的主要目標物，且甜葉菊花粉量大，蜜蜂花粉采集能力強。此外，還觀測到，同一朵小花，從剛剛開放直至盛花期，在持續(xù)4～5d的花期中，前面3～4d都觀察到有蜜蜂前來采集花粉，表明甜葉菊花粉的釋放是一個持續(xù)時間相對較長的過程，且小花的持續(xù)開放更多的是為吸引和方便蜜蜂多次前來采集花粉，并通過蜜蜂在不同植株的小花間活動來實現(xiàn)花粉的向外傳播，在此過程中，通過外露柱頭接受蜜蜂帶來的外源花粉。較一次性全部釋放完畢而言，較長的花期和花粉持續(xù)釋放時間，可吸引蜜蜂多次訪問，提高傳粉和受粉概率，更好地實現(xiàn)其雄性和雌性功能。

3.3 繁育系統(tǒng)

3.3.1 異交指數(shù) 甜葉菊小花開放時喇叭口小，喇叭口直徑為1．2±0．3mm，雄蕊先熟。由于雄蕊合生將柱頭包裹在內，柱頭和花藥接近，沒有明顯的異位。根據Dafni（1992）異交指數(shù)的計算規(guī)則，甜葉菊的異交指數(shù)為3，繁育系統(tǒng)以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。

3.3.2 花粉胚珠比（P/O比） 甜葉菊小花花粉數(shù)量為6600±3100粒，胚珠1個，P/O比為6600，依據Cruden（1977）標準，甜葉菊的繁育系統(tǒng)為專性異交系統(tǒng)。

3.3.3 花粉與柱頭的活性 甜葉菊雄性先熟，花粉在小花開放前的1/2高期即成熟并從花藥中釋放出來，此時其萌發(fā)率最高（6．1%±2．6%）；隨著成熟時間的延長，花粉萌發(fā)率逐漸下降，但直至盛花期，花粉仍保持一定的萌發(fā)率（3．0%±1．8%）（圖 2）。

甜葉菊柱頭在小花開放前無可授性，隨著小花的開放，逐漸伸出花藥筒，并開始表現(xiàn)為具有一定的可授性活性；在盛花期，柱頭絕大多數(shù)具有完全活性，并可持續(xù)1～2d（圖3）。因此，甜葉菊為雄性先熟，柱頭在伸出花藥筒后才開始具有活性。

3.3.4 套袋實驗 套袋實驗結果發(fā)現(xiàn)，自然情況下套袋沒有種子生成，表明不存在自發(fā)自交。人工自交授粉也沒有種子生成，表明甜葉菊自交不親合。相應地，天然隔離種植沒有種子生成，而作為母本和父本分別與其他株系人工雜交都獲得了成熟飽滿的種子，研究結果進一步表明甜葉菊自交不親合。

圖2 甜葉菊花器官發(fā)育進程中花粉萌發(fā)率變化情況Fig.2 Change in the germination rate of pollens at different morphogenesis stages of stevia floret

圖3 甜葉菊花器官發(fā)育進程中柱頭可授性變化情況Fig.3 Change in the receptivity of stigmas at different morphogenesis stages of stevia floret

4 討論

4.1 繁育系統(tǒng)與P/O比

從P/O比來看，甜葉菊的繁育系統(tǒng)被判斷為專性異交系統(tǒng)，與根據異交指數(shù)判斷結果（異交為主、部分自交親和、需要傳粉者）差別很大。本文的研究結果證明，甜葉菊雄性先熟，兩性成熟的重疊時間長，而且雌蕊成熟時，柱頭與花藥間基本無間隔（圖1-B）。套袋及隔離種植實驗結果表明，甜葉菊自交不親合（表1），繁育系統(tǒng)以異交為主，自交可能性低。可見，在判斷繁育系統(tǒng)時，對于甜葉菊來說，P/O比值較異交指數(shù)更合適。

甜葉菊雄蕊聚合形成花藥管，花粉向花藥管內側散粉，由柱頭及收集毛承載花粉粒，并通過柱頭的伸長，將花粉逐漸推出花藥管，實現(xiàn)花粉的分批異位呈現(xiàn)[15-16]。花藥合生成筒且花粉釋放到筒內的聚藥雄蕊結構，能使花粉分批地集中呈現(xiàn)在同一個位置，多個花粉粒一起釋放，降低花粉損耗、促進花粉輸出，使得植物不必通過生產大量花粉來保證異交花粉的成功散布[4]。

但本研究結果顯示，甜葉菊P/O比高，綜合本研究所觀察到的有關薊馬作為出現(xiàn)頻率最高、訪花時間最長的甜葉菊訪花昆蟲這一現(xiàn)象，表明甜葉菊高P/O比，似為應對薊馬等花粉取食昆蟲以及蜜蜂的采集損耗，并通過花藥管及柱頭的有效配合實現(xiàn)花粉的分批異位呈現(xiàn)，以確保雄性功能的實現(xiàn)。

表1 套袋實驗的結實情況Table1 Seed-set of bagged experiments for S. rebaudiana

4.2 傳粉生態(tài)學過程

蜜蜂以植物花粉作為蛋白質的主要來源[4]，其體表剛毛密布，在采集花粉時，粘附花粉的剛毛會不可避免地接觸到包括柱頭在內的多個部位，間接地完成了花間授粉。甜葉菊聚藥雄蕊合生在一起，并通過柱頭及收集毛將花粉粒異位呈現(xiàn)于花冠筒開口處，從而對蜜蜂的訪花行為進行約束，使蜜蜂在采集當前花朵上的花粉時，能夠將剛剛在前一朵小花中采集花粉時附著于頭部剛毛上的花粉傳遞給當前花朵的位于花藥筒上部的呈 “Y”形展開的柱頭裂片表面。同時，原位于柱頭裂片表面的當前花朵的花粉也可以附著于蜜蜂頭部的剛毛上，并隨著蜜蜂對下一朵小花的訪問，將花粉傳遞出去。這一現(xiàn)象表明，甜葉菊的花部特征可能對蜜蜂傳粉機制產生了一定的特化適應。此外，在試驗中還觀察到，蜜蜂對甜葉菊的訪問，往往是在不同植株間來回穿梭，而不集中在同一個植株上，蜜蜂的這一行為，實現(xiàn)了甜葉菊的異花授粉需求。

4.3 聚藥雄蕊

聚藥雄蕊現(xiàn)象廣泛存在于菊科、桔?？?、鳳仙花科、堇菜科、香茜科、葫蘆科、茄科及苦苣苔科等植物[5]。聚藥雄蕊植物的花部結構多表現(xiàn)為：1）花冠形成花冠筒或花冠基部合生成管狀；2）雄性先熟；花粉會通過柱頭及其表面的刷粉毛的伸長，在花藥管外異位呈現(xiàn)；3）傳粉者多為小型昆蟲或用喙伸入花內吸蜜的蝶蛾類[5]。且上述這些特征能較為普遍地關聯(lián)出現(xiàn)，可能是為了提高花內所有花粉接觸到傳粉者的可能性，促進花粉的輸出；同時，提高傳粉的準確性，降低了花粉的損耗[5，17]。與任明迅[3]有關花藥合生結構“減少了移出花藥內所有花粉的所需昆蟲訪問數(shù)”推斷不同。本研究結果表明聚藥雄蕊這一特征具有如下功能：1）為花粉及其活力的保存提供屏障。甜葉菊的花粉在花冠筒開放前已完全成熟并在花藥筒內側釋放，花朵開放后，聚藥雄蕊形成的花藥筒就成為了花粉的唯一保護器官，可以為已成熟花粉營造適宜的萌發(fā)力保存生境。2）對訪花生物的訪花行為進行規(guī)范，促進雌性和雄性功能的實現(xiàn)。聚藥雄蕊在訪花生物和花粉間提供屏障，阻止訪花生物直接接觸花藥內側的花粉，規(guī)范了訪花生物的訪花行為；通過柱頭及其表面刷粉毛的伸長，在花藥管外對花粉進行較長時間的分批異位呈現(xiàn)，延長花朵對訪花生物的花粉吸引時間，提高訪花生物來訪次數(shù)，從而提高柱頭接觸訪花生物、獲取外源花粉進行異花授粉，實現(xiàn)雌性功能，而且，還可以通過對花粉的分批釋放，降低蜜蜂的采集或薊馬的取食對花粉外傳所造成的不良影響，提高花粉外傳機會，實現(xiàn)雄性功能。

4.4 花部綜合特征

本研究結果發(fā)現(xiàn)：1）形態(tài)結構上聯(lián)合作用。聚藥雄蕊結構不是單獨存在的，而是與位于其外側發(fā)育初期密閉的花冠筒、包裹于其內側并緊密接觸的柱頭等花部結構聯(lián)合在一起，這些結構的協(xié)同作用，為花粉和柱頭的發(fā)育及活力的保存提供了良好的微生態(tài)環(huán)境。2）發(fā)育生理上雌雄異熟。為避免聚藥雄蕊結構所帶來的花粉和柱頭緊密接觸而導致的自交衰退，往往通過雌雄異熟的方式來避免自交可能。但是在本研究中，我們的研究結果表明，甜葉菊的花粉在1/2高期就開始成熟并釋放到花藥筒內壁，由于花藥筒內壁與柱頭緊密接觸，因此花粉也釋放到柱頭上，且花粉活力維持時間較長，在小花開放、柱頭裂片呈“Y”形展開后，仍具有一定萌發(fā)力。為此，雖然甜葉菊的雌雄蕊間存在一定的異熟，但并不能阻隔自身花粉和柱頭的交配。為此，甜葉菊演化出第三個策略：3）遺傳生理上的自交不親和。套袋和隔離種植試驗表明，甜葉菊自交不親和；此外，在研究中，甜葉菊花粉在自身花柱或柱頭表面萌發(fā)的現(xiàn)象非常罕見（圖4）。為此，推斷甜葉菊的自交不親和包括孢子體不親和及配子體不親和兩種情況，且以孢子體不親和為主，配子體不親和為輔，即花粉不能在自身柱頭上萌發(fā)，即使偶有萌發(fā)者，也不能實現(xiàn)真正的受精，具體情況有待進一步驗證。

最后，本研究以甜葉菊為例，揭示了聚藥雄蕊植物通過花部各組分形態(tài)結構上的聯(lián)合作用，發(fā)育生理上的雌雄異熟及遺傳生理上的自交不親和等協(xié)同作用，促進了植株雄性功能和雌性功能的協(xié)調統(tǒng)一。為此，本研究結果不僅可為聚藥雄蕊植物花部結構相關研究提供參考，也可為甜葉菊遺傳改良途徑的建立提供參考。

致謝：實驗由袁鎏柳參與數(shù)據采集、初稿撰寫，由羅慶云設計、操作、部分數(shù)據采集、圖表制作及定稿撰寫，陳思銳、楊凱祺、麥雅文等參與部分實驗材料的繁育和數(shù)據采集，陳愛彥和劉福鳳負責實驗材料的田間管理。南京農業(yè)大學農學院洪德林教授在項目實施階段提供了參考意見和有益的討論，海南大學熱帶農林學院任明迅教授對論文撰寫進行了有益的討論，在此一并致謝！

圖4 甜葉菊花粉在自身柱頭外表面的萌發(fā)侵入（圓圈中者）Fig.4 Germination and invasion of pollen on the outer surface of self stigma of stevia(in the circles)

參考文獻：

[1]Harder LD,Barrett SCH．Pollen removal from tristylous Pontederia cordata:effects of anther position and pollinator specialization[J]．Ecology,1993,74(4):1059-1072．

[2]Harder LD,Wilson WG．Floral evolution and male reproductive success:optimal dispersing schedules for pollen dispersal by animal-pollinated plants[J]．Evolutionary Ecology,1994,8(5):542-559．

[3]任明迅．雄蕊合生植物半邊蓮的花部綜合征與繁育系統(tǒng)[J]．植物生態(tài)學報，2009，33（2）：361-368．

[4]張大勇．植物生活史進化與繁殖生態(tài)學[M]．北京：科學出版社，2004．

[5]任明迅．植物雄蕊合生的多樣性、適應意義及分類學意義初探[J]．植物分類學報，2008，46（4）：452-466．

[6]黃應森，陸榮剛．甜菊栽培技術[M]．南京：江蘇科學技術出版社，1981．

[7]舒世珍．甜菊引種三十年[J]．中國種業(yè)，2010（6）：21-23．

[8]舒世珍．新糖料作物——甜葉菊在京試種成功[J]．農業(yè)科技通訊，1979（2）：19-20．

[9]龔燕兵，黃雙全．傳粉昆蟲行為的研究方法探討[J]．生物多樣性，2007，15（6）：576-583．

[10]Dafni A．Pollination Ecology:A Practical Approach[M]．Oxford University Press,Oxford,1992．

[11]Cruden RW．Pollen-ovule ratios:a conservative indicator of breeding systems in flowering plants[J]．Evolution,1977,31(1):964-974．

[12]劉巧紅，馬鶯，程大友，等．一種甜菜花粉萌發(fā)的培養(yǎng)方法[P]．中國發(fā)明專利．201510152104．9 2015-04-01．

[13]Brewbaker,J．D．and Kwack,B．H．The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth[J]．Am．J．Bot．,1963,50(9):859-865．

[14]King JR．The peroxidase reaction as an indicator of pollen viability[J]．Stain Technology,1960,35(4):225-227．

[15]Howell GJ,Slater AT,Knox RB．Secondary pollen presentation in angiosperms and its biological significance[J]．Australian Journal of Botany,1993,41(5):417-438．

[16]Castro SV,Sileira P,Navarro L．How does secondary pollen presentation affect the fitness of Polygala vayredae(Polygalaceae)?[J]．American Journal of Botany,2008,95(6):706-712．

[17]Harder LD,Johnson SD．Function and evolution of aggregated pollen in angiosperms[J]．International Journal of Plant Sciences,2008,169(1):59-78．