干制辣椒InDel-PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建及應(yīng)用

王 輝， 王 爽， 姜 童， 楊延杰， 林 多

(青島農(nóng)業(yè)大學園藝學院/青島市遺傳改良與育種重點實驗室，山東青島 266109)

辣椒(CapsicumannuumL.)屬茄科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)，是一年生或多年生草本植物[1]。干制辣椒作為辣椒的重要種類之一，是辣椒產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的主要原料，在辣椒產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要的位置[2]。我國是僅次于印度的世界干制辣椒第二大出口國，干制辣椒作為我國的傳統(tǒng)出口創(chuàng)匯品種，適種區(qū)域廣，經(jīng)濟效益高，加工增值潛力大[3]，產(chǎn)業(yè)鏈長，尤其是西北、西南、華北重要的特色經(jīng)濟作物，全國有20多個地區(qū)將干制辣椒作為當?shù)氐闹饕a(chǎn)業(yè)。

InDel(insertion-deletion)是針對基因組中插入缺失位點而設(shè)計的PCR標記，廣泛分布于基因組中[4-5]。InDel標記具有帶型簡單、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強、檢測容易的特點。應(yīng)用InDel標記技術(shù)，可在材料間親緣關(guān)系分析、關(guān)鍵基因資源拓寬、遺傳群體評價等方面進行高效研究，進而為快速高效選育優(yōu)良雜交組合奠定基礎(chǔ)。目前，在水稻[6]、玉米[7]、番茄[8]、黃瓜[9]等作物的種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系等研究領(lǐng)域已有關(guān)于InDel標記技術(shù)的研究，但對于干制辣椒InDel標記的研究尚未見報道。

InDel-PCR反應(yīng)體系構(gòu)建是InDel標記的研究基礎(chǔ)。在進行InDel-PCR擴增時，不同模板材料所要求的反應(yīng)條件不同，擴增結(jié)果易受反應(yīng)條件中諸多因素的影響[10]，為保證InDel標記的準確性和重復(fù)性，建立和優(yōu)化InDel-PCR反應(yīng)體系十分必要。本試驗以干制辣椒為材料，篩選適用于InDel-PCR的DNA提取方法，對PCR反應(yīng)條件中模板DNA濃度、引物濃度和循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化，以建立干制辣椒 InDel-PCR 反應(yīng)的最佳體系，并進一步進行InDel引物篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

干制辣椒試驗材料由青島農(nóng)業(yè)大學園藝學院干制辣椒育種課題組提供，隨機選取4份干制辣椒材料進行干制辣椒基因組DNA的提?。贿x用簇生朝天椒三櫻椒進行InDel-PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建；隨機選取其他8份干制辣椒材料進行干制辣椒InDel引物的篩選。

引物設(shè)計參照Li等開發(fā)的辣椒InDel引物[11]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 干制辣椒基因組DNA提取 采用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法和植物基因組DNA提取試劑盒法2種方法，分別提取干制辣椒材料DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳、InDel-PCR 擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳對提取的DNA進行檢測。

改良CTAB法參考Li等的方法[11]，并對取樣和研磨過程進行一定的改良，具體步驟如下：(1)取樣，在新鮮葉片上取直徑2 cm的小片，加入2 mL離心管中；(2)研磨，向離心管中加入液氮，用玻璃棒充分研磨至粉末狀。

植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，按說明書步驟提取干制辣椒植物基因組DNA。

1.2.2 InDel-PCR反應(yīng)程序的建立 設(shè)定PCR基本擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s；72 ℃延伸5 min。

PCR反應(yīng)體系循環(huán)數(shù)設(shè)置25、30、35、40次4個梯度，其余條件不變。

1.2.3 InDel-PCR擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化 選用InDel標記CIDH28為擴增引物進行擴增，設(shè)定PCR基本反應(yīng)體系：總體積15 μL，含模板DNA 3 μL，2×GoTaqR Colorless Master Mix 7.5 μL，正反向引物各1.0 μL，用ddH2O補齊至15 μL。模板DNA設(shè)置0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μL 5個梯度，正反向引物設(shè)置0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 μL 5個梯度，在保持其他因素一致的條件下，變化單一因子，每次都將上一個篩選到的某個因素的最佳值作為固定值使用到下一個因素篩選中，篩選最優(yōu)參數(shù)。取2 μL PCR產(chǎn)物，用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.4 InDel引物的篩選 利用構(gòu)建的InDel-PCR擴增程序和體系對8份樣品進行PCR擴增，參照Li等開發(fā)的辣椒InDel引物[11]對隨機挑選的60對覆蓋12條染色體的InDel標記進行多態(tài)性篩選。用聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測分析，篩選條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取檢測

由圖1的2種方法提取的干制辣椒基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果可見，2種方法提取的DNA條帶均清晰整齊、完整無雜帶，其中改良CTAB法提取的DNA亮度明顯高于試劑盒法，說明改良CTAB法提取的DNA濃度高于試劑盒法；試劑盒法提取的DNA只有少量點樣孔有雜質(zhì)，改良CTAB法提取的DNA點樣孔內(nèi)普遍存在雜質(zhì)，且有拖尾現(xiàn)象，說明試劑盒法提取的DNA純度高于改良CTAB法。

由圖2-A可以看出，以2種方法提取的DNA樣品為模板進行InDel -PCR擴增，產(chǎn)物條帶清晰，說明2種方法提取的DNA均可滿足干制辣椒InDel-PCR擴增需要。

2.2 干制辣椒InDel-PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建與優(yōu)化

設(shè)計25、30、35、40次4個循環(huán)數(shù)梯度，由圖2-B可知，25次循環(huán)擴增結(jié)果出現(xiàn)條帶缺失，不能滿足InDel分子標記的需要；30、35、40次循環(huán)擴增結(jié)果均條帶清晰，且不同循環(huán)數(shù)間無明顯差異，表明在30次循環(huán)時已達到飽和狀態(tài)。為節(jié)省試驗時間，減少非特異性擴增的影響，應(yīng)選擇30次循環(huán)。

適宜的模板量是保證特異性擴增和擴增產(chǎn)物足量的前提。由圖2-C可知，當DNA用量為0.5 μL時，無擴增條帶，當DNA用量為1.0～4.0 μL時，電泳帶型無明顯差異，均可滿足試驗需要。結(jié)合節(jié)約試驗材料和保證擴增效果兩方面考慮，本試驗選擇模板DNA量為2.0 μL，經(jīng)計算，其濃度約為30 ng/μL。

引物量對擴增效果的影響如圖2-D所示，引物用量在0.50、0.75 μL時，擴增不完全，譜帶數(shù)量少；當引物用量增至1.00～1.50 μL時，譜帶清晰穩(wěn)定，且條帶之間無明顯差異。為節(jié)約試驗成本，引物量選擇1.00 μL即可滿足試驗需要，其濃度約為0.67 μmol/L。

2.3 干制辣椒InDel-PCR反應(yīng)體系的驗證和引物篩選

選用引物CIDH293、CIDH267對構(gòu)建的InDel-PCR反應(yīng)體系進行驗證，由圖3可以看出，所有材料均能擴增出清晰的條帶且多態(tài)性好、穩(wěn)定性高，說明構(gòu)建的InDel-PCR反應(yīng)體系適用于干制辣椒InDel分析。對60對InDel引物進行PCR擴增，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。試驗結(jié)果表明，其中25對引物具有多態(tài)性，2對引物無擴增產(chǎn)物，其余引物無多態(tài)性。檢測引物在目標群體中的InDel等位基因數(shù)，共產(chǎn)生57個等位基因標記，其中7對InDel引物檢測到3個等位基因，其他18對引物均為2個等位基因。部分引物的篩選結(jié)果如圖4所示，可見引物CIDH908、CIDH426有多態(tài)性擴增，引物CIDH552、CIDH49無多態(tài)性擴增。

3 討論

InDel標記帶型簡單、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強、檢測容易，與其他分子標記相比，在基因組的同一位置出現(xiàn)相同大小的InDel標記的概率非常低，從而避免了統(tǒng)計重復(fù)的問題[12]。利用InDel標記進行作物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，大大提高了遺傳分析的重現(xiàn)性、準確性和分辨率，可解決育種過程中存在的引種中品種名稱混亂、種質(zhì)資源整理困難、育種材料間遺傳重復(fù)度高、新品種突破困難等問題。

提取高純度的模板DNA是進行InDel-PCR的前提，最經(jīng)典的DNA提取方法是CTAB法，CTAB法具有得率高、穩(wěn)定性好、費用低等優(yōu)點，但其操作步驟繁瑣、耗時，所用藥品中的異丙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等對人體毒性很大。相較之下，植物基因組DNA提取試劑盒成本較高，但操作簡單、純度高、毒害少，因此應(yīng)用越來越廣泛[13-14]。

試驗結(jié)果表明，2種提取方法提取的DNA均可滿足InDel-PCR的需要，利用植物基因組試劑盒法所提取DNA較改良CTAB法質(zhì)量高、雜質(zhì)少，但DNA得率略低，因此在模板DNA需求量小時優(yōu)先使用植物基因組試劑盒提取DNA，需求量較大時，可以采用改良CTAB法。此外，在干制辣椒DNA提取過程中，研磨技術(shù)會對DNA的提取造成很大影響，因此在研磨過程中，動作必須迅速，防止材料褐化；同時在水浴提取過程中應(yīng)多次輕輕振蕩離心管，使其充分混勻，以提取充分。

InDel-PCR擴增受到多因素影響與多個因子的綜合作用。模板DNA濃度過低，會造成沒有擴增產(chǎn)物或條帶不完全；模板DNA濃度過高，會增加反應(yīng)體系中抑制反應(yīng)的成分，出現(xiàn)非特異性擴增[15]。引物濃度對PCR的帶型產(chǎn)生顯著影響，濃度過低時擴增不完全，濃度過高時會導(dǎo)致引物二聚體的形成。循環(huán)次數(shù)是InDel-PCR擴增程序的關(guān)鍵因素，循環(huán)次數(shù)決定擴增產(chǎn)量，循環(huán)次數(shù)過少，擴增產(chǎn)物不足以滿足電泳需要，次數(shù)過多，消耗反應(yīng)物后，產(chǎn)物不會繼續(xù)增加，反而會出現(xiàn)非特異性擴增，因此在有效范圍內(nèi)，應(yīng)選擇較少的循環(huán)次數(shù)[16-17]。

本試驗通過單因素試驗設(shè)計建立了干制辣椒InDel-PCR的最佳反應(yīng)體系，通過驗證，確認了其可行性，并進一步篩選出25對InDel引物。反應(yīng)體系如下：總體積15 μL，模板DNA 2.0 μL，正反向引物各1.0 μL，2×GoTaqR Colorless Master Mix 7.5 μL，其余用ddH2O補齊。擴增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(溫度根據(jù)引物報告單Tm確定)，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

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