閆 敏， 李 磊， 張 強， 馮悅晨， 孫 捷， 武文麗

(1.山西省農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西太原 030031； 2.山西省土壤環(huán)境與養(yǎng)分資源重點實驗室，山西太原 030031)

風化煤是煤層的露頭部分長期氧化、風化、水解形成的一種低級別煤[1]，其共生的礦物質較多，富集著較多的微量元素，且含有大量再生腐殖酸(HA)和多種含氧活性官能團[2]，是腐殖酸的重要來源之一。腐殖酸不僅用于工業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保等領域[3-4]，而且廣泛用于農業(yè)[5-7]。隨著腐殖酸應用的深入研究，風化煤中的腐殖酸具有廣闊的開發(fā)利用前景。我國風化煤貯藏量豐富，集中分布于山西、新疆、內蒙古、黑龍江、云南等地區(qū)[8]，但其理化性質卻存在明顯差異，這直接影響風化煤的降解效果。隨著微生物轉化技術處理煤炭成為了國內外研究的熱點，大量的研究表明，利用微生物可顯著提高風化煤的降解效果，但受到風化煤樣品、微生物菌株及其發(fā)酵工藝等的影響，同一微生物菌株因不同風化煤樣而存在明顯的轉化差異， 不同微生物菌株對同一風化煤樣也存在明顯的

轉化差異，即微生物菌株對不同的風化煤樣存在不同的降解特性，同時發(fā)酵工藝的優(yōu)化可以提高降解率，這就使得微生物菌種與風化煤之間匹配及降解特性的研究顯得十分重要。本研究以3個不同來源的風化煤樣為研究材料，其總腐殖酸、游離腐殖酸和黃腐酸的含量存在明顯差異，篩選出具有降解作用的微生物菌株F36，并在液體培養(yǎng)條件下，從各腐殖酸含量及結構的變化上分析菌株對其的降解特性，為優(yōu)化其發(fā)酵工藝、提高風化煤的降解效率及進一步應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株F36以風化煤為唯一碳源，分離自菜園土壤，保存于筆者所在實驗室。供試3種風化煤的理化性質見表1。

表1 3種風化煤的理化性質

以上檢測由中國腐殖酸工業(yè)協(xié)會腐殖酸質量檢測中心(太原)完成。

供試培養(yǎng)基有固體定性培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基2種，其中固體定性培養(yǎng)基[9]：Na2HPO44.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，酵母浸出粉6.0 g，去離子水1 000 mL，瓊脂15～20 g；液體培養(yǎng)基[9]：(NH4)2SO42.6 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，去離子水1 000 mL，風化煤10.0 g，pH值6.0。

1.2 風化煤在固體平板上的定性降解測定

將純化的菌種F36接種到固體定性培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)；待菌絲基本長滿平板表面后，將滅菌的3個風化煤樣均勻灑在菌苔上，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察并記錄風化煤顆粒的變化情況。

1.3 風化煤降解菌株的鑒定

形態(tài)學鑒定：將菌株F36采用PDA平板、顯微鏡(乳酸石炭酸棉蘭染色)對菌落、菌絲、孢子等結構進行觀察，并參照文獻[10-11]進行鑒定。

分子生物學鑒定：將純化的菌株F36活化培養(yǎng)后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將18S rDNA測序結果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫并進行BLAST比對。

1.4 風化煤液體降解特性的研究

將菌株F36活化后，接種到液體培養(yǎng)基中，每50 mL培養(yǎng)基接種量為1/4個平板，28 ℃下培養(yǎng)7 d后離心(12 000 r/min)15 min，上清液稀釋12.5倍后測定190～280 nm(間距5 nm)的吸光度；測定上清液中黃腐酸、水溶性腐殖酸的含量[11]。同時，將上清液先用6 mol/L H2SO4調節(jié)pH值至1，形成絮狀沉淀，然后離心(12 000 r/min)15 min，沉降物在75 ℃下烘干，即得固體水溶性組分并進行FT-IR分析[9-10]。液體培養(yǎng)沉降物在75 ℃下烘至恒質量，計算損失的質量，失質量率為培養(yǎng)基中加入的風化煤質量與沉降物質量(包括菌體和未分解的風化煤)之間的差值與原加入風化煤的質量之比，用百分數(shù)表示，同時做不接種的空白對照(CK)，重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Minitab 14軟件進行統(tǒng)計分析，采用Tukey’s進行多重比較。文中圖采用Excel繪制，圖中數(shù)據(jù)表示為3個重復的“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 菌株F36對3個風化煤樣在固體定性培養(yǎng)基上的降解作用

菌株F36在固體定型培養(yǎng)基上生長，待菌絲基本長滿平板后加入3個風化煤樣繼續(xù)培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)基被染成了棕黃色，說明菌株對3個風化煤樣均出現(xiàn)了不同程度的溶媒現(xiàn)象(圖1)。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 菌株F36菌落在PDA的呈現(xiàn)橙色的色素，分生孢子梗頂端不形成膨大的頂囊，經過多次分支，產生幾輪對稱或不對稱的小梗，形如掃帚，稱為帚狀體，分生孢子為球形、橢圓形或短柱形(圖2、圖3)，初步判定為青霉屬。

2.2.2 分子生物學鑒定 將測得的18S rDNA基因序列(圖4)在NCBI上進行同源性檢索，結果表明，所測序列與青霉屬(Penicilliumsp.)同源性為99%。綜合形態(tài)特征和18S rDNA基因序列同源性兩方面分析，該菌株鑒定為青霉屬(Penicilliumsp.)。

2.3 風化煤液體降解特性的研究

2.3.1 液體培養(yǎng)下降解物紫外分析 從圖5可以看出，在液體培養(yǎng)條件下，菌株F36對3個風化煤樣培養(yǎng)的上清液的吸光度曲線即菌株對3個風化煤樣的降解特性是相似的。接種微生物處理的吸光度曲線與不接種的處理相似， 但吸光度顯著增強，并且波長越短，增加的幅度越高，其中菌株F36對YF06號風化煤的降解作用較強。這說明培養(yǎng)過程中風化煤中有大量的物質，極有可能是腐殖酸類物質轉化為水溶性狀態(tài)，所溶解出來的物質組成也受到接種的影響，吸收低波長紫外光的物質顯著增加。

2.3.2 液體培養(yǎng)下降解物紅外分析 液體培養(yǎng)后風化煤YF01降解物的紅外光譜分析結果(圖6)表明，接種菌種F36與對照相比，譜圖的形狀基本相似，在1 620 cm-1處的峰形減弱，1 540 cm-1處的有一小峰，1 400 cm-1(脂族C—H變形振動)處的峰形明顯減弱且呈現(xiàn)4個肩峰，1 240 cm-1峰形有明顯的減弱，1 120、910、600～760 cm-1處發(fā)生了不同程度的位移，而在 850 cm-1處有加強峰。說明可能是碳鏈縮短、羧基官能團和芳香共軛雙鍵含量存在差異，結構較復雜且另含有其他官能團，降解作用較強，對于失質量的效果應較為突出。

圖8顯示了液體培養(yǎng)后，風化煤YF09降解物的紅外光譜分析結果。接種菌株F36與對照相比，譜圖的形狀變得復雜且有明顯的加強作用。1 400、1 240～1 010、912、858～468 cm-1沒有明顯的特異峰，但各峰均有明顯的加強，特別是在1 400、1 240～1 010 cm-1處加強，表明其降解產物中有趨于棕腐酸類物質，有利于更好地利用，并且降解作用應在失質量和水溶性腐殖酸類物質的含量上具有較好的效果。

2.3.3 液體培養(yǎng)下風化煤的降解特性 從風化煤液體培養(yǎng)后的失質量率(圖9)變化看出，接種F36后各風化煤的失質量率明顯高于對照。對照風化煤YF01、YF06、YF09的失質量率分別是4.7%、4.3%、10.9%；接種菌株F36后的失質量率約為23.7%、20.5%、31.9%，且接種F36后，對風化煤YF01的降解效果最好。

從風化煤液體培養(yǎng)后的上清液中水溶性腐殖酸含量的變化看出，接種F36后各風化煤培養(yǎng)液中水溶性腐殖酸的含量相較于對照均明顯提高。YF01、YF06、YF09對照風化煤的培養(yǎng)液中水溶性腐殖酸含量分別是1.26%、0.29%、1.55%；接種菌株F36后的培養(yǎng)液中水溶性腐殖酸含量約為3.69%、1.74%、3.15%。其中，接種F36的培養(yǎng)液對風化煤YF06的降解效果增強幅度最大，而風化煤YF01的培養(yǎng)液中水溶性腐殖酸的含量最高(圖10)。

從風化煤液體培養(yǎng)后的上清液中黃腐酸含量的變化可以看出，接種F36后各風化煤培養(yǎng)液中黃腐酸含量相較于對照均明顯提高。YF01、YF06、YF09對照風化煤的培養(yǎng)液中黃腐酸的含量分別是0.54%、0.31%、0.59%；接種菌株F36后的培養(yǎng)液中黃腐酸的含量約為1.30%、0.76%、1.44%。其中，接種F36的培養(yǎng)液對3個風化煤樣的降解效果差異不大，而風化煤YF09的培養(yǎng)液中黃腐酸的含量最高(圖11)。

3 討論與結論

我國風化煤儲量巨大，約為1 000億t，且煤種豐富[8]。風化煤作為腐殖酸的重要來源之一，其總腐殖酸含量10%～60%，且不同風化煤樣間存在明顯的差異。筆者根據(jù)總腐殖酸、游離腐殖酸和黃腐酸的含量以及pH值的差異，選取YF01、YF06和YF09號風化煤作為研究材料，其中風化煤YF01和YF09的總腐殖酸和游離腐殖酸含量基本接近，但風化煤YF01中腐殖酸類物質含量都較高，而風化煤YF09中腐殖酸類物質含量都較低；風化煤YF06的總腐殖酸含量較高，但游離腐殖酸含量較低。以期從3個差異較大風化煤樣入手，解析它們對菌株F36降解作用的響應，為青霉菌株F36的降解機理的進一步研究和生產提供依據(jù)。

隨著利用微生物轉化煤類物質研究的廣泛開展，越來越多的微生物菌種進入了研究的范圍，主要包括白腐菌、曲霉、木霉、青霉、鏈霉菌、假單胞菌及芽孢桿菌等屬的微生物。本研究中的降解微生物是青霉，對3個風化煤樣均具有不同程度的降解作用。這些微生物以煤中腐殖酸類物質作為碳源和能源，使其發(fā)生降解，并且對煤類物質中的縮合芳香結構有較明顯的選擇性降解作用[12]，所以也使得降解效果存在明顯的差異，不同微生物與不同煤樣的作用有一定的匹配關系。韓威等對8種微生物對23個煤樣的研究表明，菌種對煤樣的生物溶媒效果差異較大[13]；張昕等研究了4種真菌降解山西臨汾和內蒙古風化煤后的失質量率，其平均差異在10%左右[9]；馮曉霄等研究的微生物菌株對新疆低階煤的轉化率為50%左右[14]；王春穎等通過優(yōu)化工藝參數(shù)使風化煤的降解率達到29.28%[15]。本研究中菌株F36對失質量率的差異在10%以上，液體培養(yǎng)后腐殖酸類物質也存在差異。紅外光譜分析表明，菌株F36對3個風化煤樣的作用集中在羧基官能團上，表現(xiàn)為水溶性腐殖酸含量的增加，而且在羧基振動上變化較多，結構復雜，可能存在多種腐殖酸類物質，有利于降解產物的利用；而且對風化煤YF01和YF06的作用集中在碳鏈的縮短上，表現(xiàn)為失質量率較高；這一結果和液體培養(yǎng)后3個風化煤樣在失質量率和水溶性腐殖酸含量的變化結果相一致。因此，可以從菌株F36對3個風化煤的降解特性差異的角度進一步對其降解機理和降解效果進行研究。

參考文獻：

[1]李善祥. 我國煤炭腐殖酸資源及其利用[J]. 腐植酸，2002(3)：7-13.

[2]武瑞平，李 華，曹 鵬. 風化煤施用對復墾土壤理化性質酶活性及植被恢復的影響研究[J]. 農業(yè)環(huán)境科學學報，2009，28(9)：1855-1861.

[3]Scott C D，Scott T C，Woodward C A. the chemical modification of enzymes to enhance solubilization in organic-solvents for interaction with coal[J]. Fuel，1993，72(12)：1695-1700.

[4]張學才，張德祥. 我國的腐殖酸資源及其工農業(yè)應用[J]. 中國煤炭，2000，26(12)：13-15，18.

[5]宋 軒，曾德慧，林鶴鳴，等. 草炭和風化煤對水稻根系活力和養(yǎng)分吸收的影響[J]. 應用生態(tài)學報，2001，12(6)：867-870.

[6]任志勝，齊瑞鵬，王彤彤，等. 風化煤對晉陜蒙礦區(qū)排土場新構土體土壤呼吸的影響[J]. 農業(yè)工程學報，2015，31(23)：230-237.

[7]何 杰，張 強，馮悅晨，等. 風化煤對蘇打鹽化土的改良效果研究[J]. 中國農學通報，2015，31(24)：199-203.

[8]馬秀欣，趙宏波. 我國泥炭、褐煤和風化煤的資源優(yōu)勢及其應用領域[J]. 中國煤炭，2004，30(9)：47-49，56.

[9]張 昕，林啟美，趙小蓉. 風化煤的微生物轉化：Ⅰ菌種篩選及轉化能力測定[J]. 腐植酸，2002(3)：18-23.

[10]魏景超遺. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上?？茖W技術出版社，1979.

[11]齊祖同. 中國真菌志(第35卷)[M]. 北京：科學出版社，1997.

[12]陳文求，王仁宗，陳敏杰，等. 腐殖酸的降解研究及進展[J]. 化工進展，2013，32(增刊1)：207-212.

[13]韓 威，佟 威，楊海波，等. 煤的微生物溶(降)解及其產物研究[J]. 大連理工大學學報，1994，34(6)：653-660.

[14]馮曉霄，楊紅梅，張 濤，等. 新疆低階煤微生物轉化菌種的選育及轉化能力測定[J]. 新疆農業(yè)科學，2014，51(3)：511-516.

[15]王春穎，田瑞華，段開紅，等. 一株放線菌降解風化煤的工藝研究[J]. 內蒙古農業(yè)大學學報(自然科學版)，2011，32(2)：166-169.