辛順佳， 楊虹琦， 熊 偉， 楊俊興， 楊紅武， 嚴永旺

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128)

近年來，我國化學(xué)除草劑用量和使用面積呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。據(jù)全國農(nóng)技推廣中心統(tǒng)計，2009年全國雜草發(fā)生面積0.89億hm2，化學(xué)防除面積達0.91億hm2，挽回糧食損失 2 141萬t[1]。由于化學(xué)除草劑具有速度快、防效好、省力、省工等優(yōu)點，因此被農(nóng)民廣泛使用。研究表明，這些除草劑有70%會進入土壤[2]，并且對土壤微生物的活動產(chǎn)生影響[3-4]，進而影響土壤中有機物質(zhì)的分解速度。微生物是土壤有機物質(zhì)的最早來源，雖然土壤中微生物數(shù)量占有機物質(zhì)總量的比例很少，但它們對土壤有機物質(zhì)的轉(zhuǎn)化起著非常重要的作用。土壤有機物質(zhì)是指那些進入土壤中尚未被微生物分解的動植物殘體，其中含氮化合物主要是由各種氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，并且大部分蛋白質(zhì)須要經(jīng)過微生物分泌產(chǎn)生的蛋白酶作用才能被分解和利用。因此，土壤中產(chǎn)蛋白酶微生物的種群結(jié)構(gòu)、數(shù)量及其分泌蛋白酶活性與土壤有機物質(zhì)中蛋白質(zhì)的分解速度密切相關(guān)，并且在一定程度上可以反映土壤有機質(zhì)礦化的速率[5-6]。對湖南省煙稻輪作地區(qū)耕層土壤養(yǎng)分調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其土壤有機質(zhì)有逐年升高的趨勢，雖然有關(guān)除草劑對土壤微生物群落影響的相關(guān)研究報道較多[7-9]，但未見針對湖南省煙稻輪作地區(qū)耕層土壤分離的產(chǎn)蛋白酶細菌種屬及其分泌蛋白酶活性研究的報道。本試驗選取生產(chǎn)上廣泛使用且作用機制不同的3種除草劑(二甲戊靈、異丙甲草胺和精喹禾靈)為試驗材料，系統(tǒng)研究了土壤中分離的產(chǎn)蛋白酶細菌種屬及不同除草劑對細菌蛋白酶活性的影響，為探明湖南省煙稻輪作地區(qū)土壤有機質(zhì)逐年升高與大量使用化學(xué)除草劑是否有關(guān)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 供試高有機質(zhì)土壤樣品采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園(YY)、湖南省寧鄉(xiāng)縣橫市鎮(zhèn)(NX)、湖南省邵陽市橫板橋鄉(xiāng)(SY)。經(jīng)檢測已知耘園土壤有機質(zhì)平均含量為 25.92 g/kg，寧鄉(xiāng)土壤有機質(zhì)平均含量為33.29 g/kg，邵陽土壤有機質(zhì)平均含量為40.83 g/kg。

1.1.2 供試除草劑 供試除草劑為33%二甲戊靈乳油、720 g/L 異丙甲草胺乳油和10%精喹禾靈乳油，均由市場采購。

1.1.3 培養(yǎng)基 (1)酪素培養(yǎng)基。KH2PO40.360 g，MgSO4·7H2O 0.500 g，ZnCl20.014 g，Na2HPO4·7H2O 1.070 g，NaCl 0.160 g，CaCl20.002 g，F(xiàn)eSO40.002 g，干酪素4.000 g，瓊脂20.000 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0～7.2。(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 L，pH值為7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 土壤產(chǎn)蛋白酶細菌的分離純化 稱取5 g清除殘根雜物的土壤樣品，倒入含有45 mL無菌水的150 mL錐形瓶中，振蕩20 min，使土樣充分打散，即成為10-1的土壤懸液。用移液槍吸10-1的土壤懸液1 mL，放入9 mL無菌水中即為10-2稀釋液，如此重復(fù)，依次制成10-3、10-4、10-5的稀釋液，分別涂布于酪素培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)2 d后，挑取產(chǎn)生蛋白水解圈的菌落，進一步劃線直到得到單菌落，對菌株進行編號，斜面保存，置于4 ℃冰箱中。

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶細菌的初篩 將分離純化得到的菌種接種到酪素培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑選生長良好、蛋白水解圈明顯較大且透明度高的單菌落，測量其水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)。

1.2.3 產(chǎn)蛋白酶細菌的復(fù)篩 在250 mL錐形瓶中加入液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌30 min，將初篩得到的菌株分別接種于培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，離心培養(yǎng)液，取上清液1 mL測蛋白酶活性。從每份土壤中選擇形態(tài)各不相同且酶活性最高的1株細菌作為不同劑量除草劑對細菌及其分泌蛋白酶活性影響的試驗菌株。

1.2.4 產(chǎn)蛋白酶細菌種屬鑒定

1.2.4.1 形態(tài)觀察和生理生化鑒定 在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]和《微生物學(xué)實驗指導(dǎo)》[11]對菌株進行革蘭氏染色、接觸酶、甲基紅、硝酸鹽還原、淀粉水解、葡萄糖發(fā)酵、V-P試驗等生理生化鑒定。

1.2.4.2 16S rRNA基因測序 委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行菌株的16S rRNA基因測序，所得結(jié)果在 GenBank 中進行Blast搜索同源序列，并利用Mega 5.0軟件進行同源性分析以確定菌種。

1.2.5 除草劑對細菌產(chǎn)蛋白酶活性的影響 將已鑒定出的細菌以1%的接種量接種到酪素體培養(yǎng)基中，加入不同濃度的除草劑。其中，二甲戊靈使用濃度為0.099、0.198、0.396、0.792、1.584 mg/mL，異丙甲草胺使用濃度為0.36、0.72、1.44、2.88、5.76 mg/mL，精喹禾靈使用濃度為0.033、0.066、0.132、0.264、0.528 mg/mL；以不加除草劑的酪素體培養(yǎng)基為對照。37 ℃搖床培養(yǎng)48 h，離心培養(yǎng)液，取上清液測蛋白酶活性和游離氨基酸含量。

1.2.6 蛋白酶活性測定 取5 mL 0.6%酪蛋白溶液于試管中，40 ℃預(yù)熱2 min后加19 mL pH值為8的硼酸緩沖液和 1 mL 酶液，40 ℃水浴反應(yīng)10 min，再加5 mL 0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)，40 ℃保溫20 min，沉淀殘余底物并過濾，濾液在275 nm下用紫外分光光度計測定吸光度。以先加三氯乙酸使酶失活的試管為空白對照，以1 min內(nèi)由酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物在275 nm處的吸光度與1 μg的酪氨酸相當時，其所需的酶量為1個單位，單位為U/mL。

1.2.7 游離氨基酸含量測定 采用茚三酮顯色法測定[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤產(chǎn)蛋白酶細菌篩選

從3份供試土壤中共計篩選出37株產(chǎn)蛋白酶細菌，菌種編號、透明圈直徑與菌落直徑之比及細菌蛋白酶活性的測定結(jié)果見表1。根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑之比及蛋白酶活性，選擇蛋白酶活性較高的YY-4、NX-3和SY-2菌株進行生理生化特性及16S rRNA基因分析和鑒定。但通過觀察發(fā)現(xiàn)，YY-4和SY-2菌落形態(tài)相似，因此SY地點選用 SY-9 菌株進行試驗。YY-4菌株蛋白酶活性最高，其次為NX-3菌株，SY-9菌株蛋白酶活性最小。

表1 產(chǎn)蛋白酶細菌篩選結(jié)果

2.2 產(chǎn)蛋白酶細菌鑒定

2.2.1 產(chǎn)蛋白酶細菌形態(tài)與生理生化特性 YY-4菌落為乳白色、圓形突起、表面光滑、白蠟狀；NX-3菌落顏色為乳白色偏黃、圓形、表面光滑、濕潤；SY-9菌落為乳黃色、不規(guī)則形蔓延、半透明、表面光滑、濕潤。3株產(chǎn)蛋白酶細菌主要生理生化指標分析結(jié)果見表2。3種細菌的革蘭氏染色、接觸酶、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)酸和葡萄糖產(chǎn)氣特性均相同，但甲基紅顯色、淀粉水解和V-P特性有所不同。

注：“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)。

2.2.2 產(chǎn)蛋白酶細菌16S rRNA基因鑒定 3種細菌16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物電泳圖譜見圖1。經(jīng)測序得到的16S rRNA基因序列長度分別為YY-4長1 496 bp；NX-3長 1 496 bp；SY-9長1 492 bp。將得到的基因序列與Blast、GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，并利用Mega 5.0軟件進行同源性分析，根據(jù)細菌鑒定中核糖體基因16S區(qū)域同源性大于99%可視為同一個種屬的準則，確定菌株YY-4為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)；NX-3菌株為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)；SY-9菌株為短小芽孢桿菌(B.pumilus)。

2.3 除草劑對3種細菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響

2.3.1 二甲戊靈對3種細菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響 二甲戊靈通常作為芽前、芽后旱田土壤除草劑[13]，廣泛應(yīng)用于玉米、大豆、馬鈴薯、煙草、蔬菜等田地除草。二甲戊靈對3種細菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響見圖2、圖3。結(jié)果顯示，二甲戊靈濃度低于 0.198 mg/mL 時，對蠟樣芽孢桿菌和NX-3菌株蛋白酶活性無抑制作用，但對短小芽孢桿菌蛋白酶活性有抑制作用；當二甲戊靈濃度超過0.198 mg/mL后，3種菌株產(chǎn)蛋白酶活性均迅速下降。蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液中氨基酸含量的變化與蛋白酶活性變化基本一致，但在低濃度的二甲戊靈中，NX-3菌株和短小芽孢桿菌培養(yǎng)液的氨基酸含量持續(xù)下降。由此可見，二甲戊靈對短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和NX-3菌株產(chǎn)蛋白酶活性均有抑制作用，并且低濃度的二甲戊靈(超過 0.198 mg/mL時)對短小芽孢桿菌、 NX-3 菌株的抑制作用較強，對蠟樣芽孢桿菌的抑制作用相對較弱。

2.3.2 異丙甲草胺對3種細菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響 異丙甲草胺是一種選擇性苗前使用的土壤除草劑[14]，可用于棉花、花生、馬鈴薯、煙草等田地除草。異丙甲草胺對3種細菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響見圖4、圖5。異丙甲草胺濃度低于0.36 mg/mL時，對蠟樣芽孢桿菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量均無抑制作用，但對NX-3菌株和短小芽孢桿菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量有一定的抑制作用；異丙甲草胺濃度超過0.36 mg/mL后，蠟樣芽孢桿菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量均急速下降。說明當異丙甲草胺濃度超過0.36 mg/mL后對3種細菌蛋白酶活性都有較強的抑制作用。

2.3.3 精喹禾靈對3種細菌蛋白酶活性及培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響 精喹禾靈是一種新型的芳基苯氧基丙酸類除草劑[15]，可用于大豆、煙草、棉花、花生、油菜等田地除草。精喹禾靈對3種細菌蛋白酶活性及細菌培養(yǎng)液中氨基酸含量的影響見圖6、圖7。結(jié)果表明，低濃度的精喹禾靈對蠟樣芽孢桿菌、NX-3菌株、短小芽孢桿菌蛋白酶活性和培養(yǎng)液中氨基酸含量都有很強的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

前人研究結(jié)果表明，2，4-D[3]、阿特拉津[4]、草甘膦[8]、芐嘧磺隆[9]等除草劑會影響土壤細菌的數(shù)量；甲磺隆的施入不僅會影響微生物生物量和微生物群落結(jié)構(gòu)，而且對土壤微生態(tài)系統(tǒng)會產(chǎn)生一定的破壞作用[16]。滕春紅等的研究表明，氟磺胺草醚對土壤蛋白酶活性表現(xiàn)出抑制作用，低濃度(5、10 μg/kg)的氯嘧磺隆對蛋白酶活性有輕微的激活作用，而高濃度(20、100 μg/kg)的氯嘧磺隆對蛋白酶活性有抑制作用[17-18]。本試驗研究了二甲戊靈、異丙甲草胺、精喹禾靈這3種除草劑，發(fā)現(xiàn)它們在低濃度時均對蠟樣芽孢桿菌、NX-3菌株、短小芽孢桿菌的蛋白酶活性有明顯的抑制作用。但由于這3種除草劑的作用機制各不相同，所以相同條件下對不同細菌蛋白酶活性的影響略有不同。

土壤蛋白酶是土壤氮素礦化過程中的重要水解酶，其酶活性在一定程度上可以反映土壤中分泌蛋白酶細菌的數(shù)量，也可以反映土壤氮素礦化的速率。Kamimura等研究表明，蛋白酶與全氮礦化速率呈顯著正相關(guān)關(guān)系[6]。因此，揭示不同除草劑對細菌蛋白酶活性的影響將為除草劑對土壤礦化速率影響的研究奠定堅實的理論和試驗基礎(chǔ)。本試驗僅以高有機質(zhì)土壤中分離出的3種產(chǎn)蛋白酶活性較高的細菌為供試對象，研究除草劑二甲戊靈、異丙甲草胺、精喹禾靈對細菌蛋白酶活性的影響，而這3種除草劑是否對細菌分泌的其他水解酶或氧化酶活性有抑制作用還有待今后做進一步的研究。

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