2種藥用甘草種子對(duì)鹽漬環(huán)境的萌發(fā)響應(yīng)及其甘草酸含量變化

沈步芳， 李予霞， 馬 淼， 李桂芳， 肖星輝， 劉惠東， 馮 雪， 莊 麗， 劉紅玲，2

(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000； 2.成都師范學(xué)院，四川成都 611130)

新疆為遠(yuǎn)離海洋的內(nèi)陸盆地，其鹽漬土地面積約占全國鹽堿土面積的1/3，達(dá)11萬km2，是我國土壤鹽堿化分布面積最廣、類型最多、積鹽最重的地區(qū)。當(dāng)土壤中的水溶性鹽濃度大于0.1%時(shí)，便會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生鹽害，鹽害程度隨濃度的增大而增大，種子萌發(fā)階段對(duì)土壤中的鹽堿濃度尤為敏感，因此土壤鹽漬化是造成新疆農(nóng)業(yè)低產(chǎn)的重要原因之一，嚴(yán)重影響了新疆干旱區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展和綠洲生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定[1]。新疆傳統(tǒng)的改良鹽堿土的方法需要大量的水作保證，成本高但效果不理想，利用鹽生植物修復(fù)土壤，能夠有效改善鹽堿地區(qū)生態(tài)環(huán)境，推進(jìn)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展。

脹果甘草(Glycyrrhizainflata)和烏拉爾甘草(Glycyrrhizauralensis)是豆科多年生草本植物，脹果甘草主要分布于新疆地區(qū)，烏拉爾甘草廣泛分布于我國北方地區(qū)[2-3]，皆為《中國藥典》收載的藥用甘草的原植物。甘草因其生境較耐鹽堿、抗旱、耐寒、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性及其獨(dú)特的藥用價(jià)值，已成為我國西北干旱、半干旱區(qū)鹽堿地植被恢復(fù)與資源重建的重要藥用植物[4]。甘草酸是甘草的主要藥用活性成分，常作為甘草制劑中的定量指標(biāo)來評(píng)價(jià)藥材及成藥的質(zhì)量[5]。目前對(duì)甘草的研究主要集中在資源、分類、化學(xué)成分、藥理和藥效等方面[6-10]，對(duì)甘草種子生理生態(tài)學(xué)方面的研究較少，種子耐鹽性的研究報(bào)道也僅見于烏拉爾甘草[11-13]，鹽脅迫下甘草種子萌發(fā)進(jìn)程中甘草酸積累與鹽環(huán)境之間的相關(guān)關(guān)系未見報(bào)道。本研究在不同濃度的3種鹽脅迫下對(duì)脹果甘草和烏拉爾甘草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、萌發(fā)進(jìn)程、種子活力、鹽脅迫解除后種子的發(fā)芽率及不同濃度鹽溶液處理下種子中內(nèi)源甘草酸的含量等指標(biāo)進(jìn)行測定，揭示了2種主栽藥用甘草種子的萌發(fā)特性，探討了荒漠生境下甘草的種植對(duì)策。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脹果甘草和烏拉爾甘草種子于2013年采自新疆石河子大學(xué)甘草研究所。脹果甘草種子千粒質(zhì)量為8.547 6 g，烏拉爾甘草種子千粒質(zhì)量為8.978 8 g。鹽處理所用試劑(NaCl、Na2SO4和Na2CO3)均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理方法 試驗(yàn)于2016年4月在石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，分別選大小均勻的2種甘草的健康種子，用0.5%高錳酸鉀溶液浸種消毒10 min，再用無菌水沖洗干凈，吹干后置于小燒杯中，用85%濃硫酸浸泡種子 20 min，用無菌蒸餾水反復(fù)沖洗干凈后備用。將NaCl、Na2SO4、Na2CO3鹽分別配制成40、80、120、160、200、240、280、320、360、400 mmol/L等10個(gè)濃度的單鹽溶液，備用。

選用直徑9 cm的培養(yǎng)皿，無菌水沖洗后放入2層無菌濾紙，壓平，分別用上述濃度的單鹽溶液浸泡種子12 h，讓種子充分吸足水分，然后每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放入50粒經(jīng)過預(yù)處理的種子，并加入8 mL相應(yīng)濃度的單鹽溶液，5次重復(fù)，并以蒸餾水處理為對(duì)照(CK)，放入(25±2)℃恒溫箱內(nèi)，光照 4 000 lx，12 h/d催芽。24 h后開始逐日觀察，直至種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束。為保持培養(yǎng)皿中的鹽溶液濃度穩(wěn)定并且減少因種皮褐化而影響種子發(fā)芽和導(dǎo)致霉變，每天更換濾紙，并以相應(yīng)濃度鹽溶液沖洗種子及培養(yǎng)皿。

1.2.2 觀測方法及評(píng)價(jià)指標(biāo) 將處理好的培養(yǎng)皿放入恒溫箱后，每隔24 h觀察1次，以重復(fù)中最早的1粒種子發(fā)芽之日作為該處理萌發(fā)的開始期，以胚根露出0.2 cm作為萌發(fā)標(biāo)志[14]，直至萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束。統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和相對(duì)鹽害率[15]。發(fā)芽結(jié)束后，將全部未發(fā)芽種子沖洗干凈，以相同條件在蒸餾水中繼續(xù)復(fù)水萌發(fā)，并用相同方法計(jì)算發(fā)芽率(鑒于不同濃度鹽溶液處理種子數(shù)量有限，因此只做種子發(fā)芽率小于50%的鹽濃度下的復(fù)水試驗(yàn))。

發(fā)芽率=種子發(fā)芽粒數(shù)/種子播種總粒數(shù)×100%；發(fā)芽勢=3～7 d發(fā)芽種子總數(shù)/種子播種總粒數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt(Gt為td的發(fā)芽率，Dt為相應(yīng)種子發(fā)芽的天數(shù)，按8 d計(jì))；活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×S(S為胚根+胚軸的總平均長度，cm)；相對(duì)鹽害率=(對(duì)照發(fā)芽率-鹽處理發(fā)芽率)/對(duì)照發(fā)芽率×100%。用直尺測量2種甘草種子胚根和胚軸長度，分別計(jì)算平均值。

1.2.3 耐鹽界限的確定[16]種子最終發(fā)芽率達(dá)到對(duì)照75%以上時(shí)的鹽濃度為種子萌發(fā)的耐鹽適宜范圍；最終發(fā)芽率達(dá)對(duì)照50%時(shí)的鹽濃度為種子萌發(fā)的耐鹽臨界值；最終發(fā)芽率為0時(shí)的鹽濃度為種子萌發(fā)的耐鹽極限值。

1.2.4 甘草酸含量的提取與測定 將發(fā)芽率大于50%的各鹽溶液處理7 d的2種甘草種子分別收集并放入105 ℃烘箱中殺青15 min，再以70 ℃烘干、粉碎、過60目篩備用(發(fā)芽率過低，樣品量太少)。采用香草醛-高氯酸法測定甘草酸含量[17-18]。

1.2.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù) 采用SPSS 23.0進(jìn)行方差分析和線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種鹽脅迫對(duì)2種甘草種子發(fā)芽天數(shù)的影響

分別用蒸餾水、中性鹽較佳發(fā)芽濃度(Na2SO4120 mmol/L、NaCl 200 mmol/L)和堿性鹽較低濃度(Na2CO380 mmol/L)處理2種甘草種子，24 h內(nèi)開始發(fā)芽，3 d后出現(xiàn)日發(fā)芽率高峰，7 d后無新增發(fā)芽種子，少數(shù)種子出現(xiàn)發(fā)霉腐爛。因此，鹽溶液處理和對(duì)照處理的2種甘草種子的累計(jì)發(fā)芽時(shí)間為7～8 d。

2.2 3種鹽脅迫對(duì)2種甘草種子發(fā)芽率的影響

從圖1可以看出，在3種單鹽溶液處理?xiàng)l件下，2種甘草種子的發(fā)芽率除在較低中性鹽溶液濃度(Na2SO4、NaCl濃度<80 mmol/L)時(shí)高于對(duì)照外，在其他鹽濃度處理下均下降。不同單鹽對(duì)2種甘草種子萌發(fā)的抑制程度存在顯著差異，在Na2CO3脅迫下發(fā)芽率下降最為劇烈，方差分析和多重比較結(jié)果表明，在較低Na2CO3鹽濃度下，2種甘草種子發(fā)芽率即與對(duì)照存在顯著差異，表明Na2CO3對(duì)種子萌發(fā)的抑制程度最強(qiáng)。同一單鹽對(duì)不同甘草種子發(fā)芽率的影響也存在明顯差異，與脹果甘草種子相比，烏拉爾甘草種子在3種單鹽脅迫下發(fā)芽率降低得較快，堿性鹽和較高濃度中性鹽脅迫與對(duì)照間發(fā)芽率存在著顯著差異。

2.3 3種鹽脅迫下2種甘草種子的萌發(fā)進(jìn)程

種子初始萌發(fā)時(shí)間、發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽高峰期反映了種子的萌發(fā)啟動(dòng)速度(圖2)，當(dāng)中性鹽在較低濃度(NaCl、Na2SO4濃度為80～160 mmol/L)時(shí)，種子均從1 d后開始萌發(fā)，3 d后出現(xiàn)發(fā)芽高峰期，與對(duì)照一致，但日發(fā)芽率卻高于對(duì)照，說明低鹽促進(jìn)了種子萌發(fā)；當(dāng)NaCl鹽溶液濃度在240 mmol/L時(shí)，發(fā)芽高峰期雖與對(duì)照一致，但日發(fā)芽率卻比對(duì)照低，表明在此濃度下，種子的萌發(fā)已開始受到抑制。Na2CO3鹽溶液在較低濃度下即對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，發(fā)芽高峰期延后，而Na2SO4鹽溶液濃度大于240 mmol/L和NaCl鹽溶液濃度大于320 mmol/L時(shí)，種子的日發(fā)芽高峰期才開始延后，且隨著鹽濃度上升愈加明顯?？梢钥闯觯琋a2CO3脅迫抑制作用顯著強(qiáng)于NaCl和Na2SO4；不同種類鹽脅迫對(duì)2種藥用甘草種子萌發(fā)速度的降低程度存在顯著差異，且鹽脅迫對(duì)烏拉爾甘草種子萌發(fā)速度的抑制程度強(qiáng)于脹果甘草種子。

2.4 鹽脅迫對(duì)2種甘草種子其他相關(guān)萌發(fā)指標(biāo)的影響

圖3至圖6分別表示的是不同單鹽脅迫對(duì)2種甘草種子發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、相對(duì)鹽害率的影響。中性鹽脅迫下，2種甘草種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨著鹽濃度增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。脹果甘草種子在Na2SO4濃度為 160 mmol/L 和NaCl濃度為80 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出了最高的發(fā)芽勢，在Na2SO4濃度為120 mmol/L和NaCl濃度為 120 mmol/L 時(shí)表現(xiàn)出了最高的發(fā)芽指數(shù)，在Na2SO4濃度為80 mmol/L和NaCl濃度為80 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出了最高的活力指數(shù)。烏拉爾甘草種子在Na2SO4濃度為 120 mmol/L 和NaCl濃度為120 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出了最高的發(fā)芽勢，在Na2SO4濃度為80 mmol/L和NaCl濃度為 120 mmol/L 時(shí)表現(xiàn)出了最高的發(fā)芽指數(shù)，在Na2SO4濃度為80 mmol/L和NaCl濃度為80 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出了最高的活力指數(shù)。堿性鹽脅迫下，隨著鹽濃度的增加，2種甘草種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與對(duì)照相比均顯著下降。相對(duì)鹽害率的分析也驗(yàn)證了上述結(jié)果，即低濃度中性鹽有利于種子萌發(fā)，堿性鹽和高濃度中性鹽抑制了種子萌發(fā)。

2.5 3種鹽脅迫對(duì)2種甘草種子胚生長的影響

一定濃度的鹽脅迫均對(duì)2種藥用甘草胚的生長有抑制作用，表現(xiàn)為隨著鹽濃度的上升，萌發(fā)種子的胚根和胚軸總長度總體呈下降趨勢(圖7)。脹果甘草在低鹽(Na2SO4濃度0～80 mmol/L、NaCl濃度0～80 mmol/L、Na2CO3濃度0～40 mmol/L)范圍內(nèi)，萌發(fā)種子的胚根和胚軸總長度與對(duì)照相比雖有所增加，但并無顯著差異，在NaCl濃度為120 mmol/L時(shí)，萌發(fā)種子的總胚長與對(duì)照相比顯著增加，說明此濃度有利于脹果甘草種子胚的生長。對(duì)烏拉爾甘草種子而言，鹽脅迫對(duì)其影響與脹果甘草類似，在低鹽(Na2SO4濃度0～80 mmol/L、NaCl濃度0～120 mmol/L)范圍內(nèi)，種子萌發(fā)總長度與對(duì)照相比無顯著差異，但在NaCl為80 mmol/L時(shí)，萌發(fā)種子的總胚長與對(duì)照相比顯著增加，Na2CO3在較低濃度時(shí)就顯著抑制了胚長，且抑制作用明顯強(qiáng)于脹果甘草。就萌發(fā)種子胚的生長情況來看，脹果甘草相比烏拉爾甘草更耐堿性鹽。

2.6 2種甘草種子在3種鹽脅迫下的耐鹽范圍

表1所示的是2種甘草種子發(fā)芽率與鹽度的相關(guān)回歸方程，分析“濃度-發(fā)芽率”關(guān)系可知2種甘草種子鹽脅迫下的耐鹽界限。脹果甘草耐鹽臨界值為：Na2SO40～248.35 mmol/L、NaCl 0～299.02 mmol/L、Na2CO30～151.20 mmol/L；耐鹽極限值為：Na2SO40～406.35 mmol/L、NaCl 0～496.37 mmol/L、Na2CO30～298.0 mmol/L。烏拉爾甘草耐鹽臨界值為：Na2SO40～230.96 mmol/L、NaCl 0～278.36 mmol/L、Na2CO30～136.94 mmol/L；耐鹽極值為：Na2SO40～395.66 mmol/L、NaCl 0～474.26 mmol/L、Na2CO30～289.34 mmol/L。這進(jìn)一步說明了脹果甘草種子的耐鹽能力強(qiáng)于烏拉爾甘草種子。

2.7 2種甘草種子鹽脅迫解除后萌發(fā)能力分析

通過復(fù)水試驗(yàn)，鹽脅迫下未萌發(fā)的種子活力并未完全喪失，中性鹽脅迫下，脹果甘草種子鹽脅迫解除后的發(fā)芽率均高于烏拉爾甘草種子，但兩者均表現(xiàn)出了較高的發(fā)芽率(48%～88%)；堿性鹽脅迫下，雖然烏拉爾甘草種子的發(fā)芽率較高，但其在Na2CO3濃度為160 mmol/L時(shí)的發(fā)芽率卻為0，說明其比脹果甘草耐高濃度堿性鹽的能力弱。相比于中性鹽，2種甘草均不耐堿性鹽，鹽脅迫解除后的發(fā)芽率最高才能達(dá)到32%，且隨著鹽溶液濃度的增加而迅速降低(圖8)。

表1 2種甘草種子發(fā)芽率與鹽度的相關(guān)回歸方程

2.8 3種鹽脅迫對(duì)2種甘草種子萌發(fā)過程中甘草酸含量的影響

水培對(duì)照處理的脹果甘草萌發(fā)種子中甘草酸含量為 2.56 mg/g，烏拉爾甘草萌發(fā)種子中甘草酸含量為3.09 mg/g。中性鹽脅迫下，2種甘草種子種內(nèi)源甘草酸的含量總體呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，且在Na2SO4和NaCl度均為 80 mmol/L 時(shí)達(dá)到最高值，與對(duì)照相比差異顯著。堿性鹽嚴(yán)重抑制了2種甘草種子甘草酸的合成，隨著鹽濃度的升高，其甘草酸含量與對(duì)照相比顯著降低。烏拉爾甘草種子中內(nèi)源甘草酸含量高于脹果甘草種子，應(yīng)與品種有關(guān)(圖9)。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，2種藥用甘草種子萌發(fā)期對(duì)3種鈉鹽(Na2SO4、NaCl和Na2CO3)脅迫的響應(yīng)基本一致，但對(duì)不同鹽種類響應(yīng)程度的差異較大。低濃度中性鹽(Na2SO4、NaCl)溶液有利于種子的萌發(fā)，并且能夠促進(jìn)胚根和胚軸的伸長生長，表現(xiàn)為種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均有所升高。但中性鹽溶液濃度高于一定值時(shí)，抑制了2種甘草種子的萌發(fā)，且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。堿性鹽(Na2CO3)溶液在較低濃度時(shí)就嚴(yán)重抑制了種子的萌發(fā)，且其相對(duì)2種中性鹽(Na2SO4、NaCl)溶液對(duì)甘草種子萌發(fā)的影響較強(qiáng)，這與陸嘉惠等研究鹽脅迫對(duì)烏拉爾甘草和光果甘草種子萌發(fā)影響的結(jié)果[18-20]相似。低濃度中性鹽促進(jìn)種子萌發(fā)的原因可能是低濃度鹽分促進(jìn)了細(xì)胞膜的滲透調(diào)節(jié)，也可能是微量的無機(jī)離子對(duì)呼吸酶有一定的激活作用，從而提高了種子的各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)；高濃度鹽分脅迫降低種子儲(chǔ)藏物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化速率，損傷膜脂和膜蛋白，抑制種子萌發(fā)[21]。其響應(yīng)機(jī)制與不同物種長期生存條件，尤其是氣候、土壤條件密切相關(guān)。脹果甘草和烏拉爾甘草生境土壤常輕度、中度或重度鹽漬化，剛好與鹽脅迫及解除鹽脅迫處理下甘草種子萌發(fā)的響應(yīng)一致，表明土壤鹽濃度高時(shí)，能避開逆境，延緩萌發(fā)，在降雨表層土壤鹽分下降后能夠迅速恢復(fù)萌發(fā)、生長，這是2種甘草種子萌發(fā)對(duì)鹽漬環(huán)境的適應(yīng)策略。

離子毒害和滲透效應(yīng)被認(rèn)為是鹽對(duì)植物種子鹽害作用的主要表現(xiàn)。在種子萌發(fā)期，這2種效應(yīng)作用往往同時(shí)存在，通?？赏ㄟ^種子復(fù)水試驗(yàn)來判斷這2種效應(yīng)的作用大小。一些鹽生植物種子從鹽溶液轉(zhuǎn)到淡水中可以獲得全部萌發(fā)，滲透效應(yīng)大于離子毒害[21]。本試驗(yàn)中，中性鹽脅迫下2種甘草種子鹽脅迫解除后的發(fā)芽率較高，說明鹽脅迫下種子的低發(fā)芽率主要是滲透效應(yīng)造成的，而堿性鹽處理下，2種甘草種子復(fù)水后的發(fā)芽率仍然很低，說明堿性鹽破壞了種子活性，其對(duì)種子的脅迫效應(yīng)主要為離子毒害。

大多數(shù)研究表明，逆境脅迫有利于植物次生代謝產(chǎn)物的累積，甚至有些次生代謝產(chǎn)物是同植物在逆境脅迫的協(xié)同作用下而產(chǎn)生的[22-23]。甘草酸既是甘草的主要次生代謝產(chǎn)物，又是一種天然非離子型表面活性劑，它能維持膜表面的液化狀態(tài)，在鹽與膜之間形成鹽橋，緩解鹽在膜上的結(jié)晶，從而能夠通過維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和清除自由基來減少鹽害[24]。試驗(yàn)結(jié)果表明，烏拉爾甘草種子萌發(fā)過程中甘草酸含量高于脹果甘草，但其種子萌發(fā)抗鹽堿性指標(biāo)卻低于后者，其機(jī)制還有待深入研究。由于發(fā)芽期和幼苗期是植物對(duì)鹽脅迫最敏感的時(shí)期[25]，可通過推測種子萌芽期的耐鹽性來反映該品種在其他時(shí)期的耐鹽性。因此，可在甘草種植過程中，先測定土壤鹽堿度再選擇適當(dāng)?shù)柠}環(huán)境脅迫來提高甘草酸含量，精準(zhǔn)地營造既增加產(chǎn)量，又提高其活性成分的生境條件，對(duì)提高藥用植物的藥用價(jià)值和種植效益具有重要意義。

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