陳鐵柱， 文飛燕， 夏燕莉， 楊玉霞， 方清茂， 張 浩， 薛 丹

(1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都 610041； 2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都 610041)

七葉一枝花[ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara]是2015年版《中國(guó)藥典》收載的重樓藥材的2種基原植物之一[1]，別稱華重樓，屬二級(jí)瀕危物種。其根狀莖入藥，是傳統(tǒng)的中藏彝傣醫(yī)藥體系常用的大宗藥材，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，為云南白藥系列產(chǎn)品、沈陽(yáng)紅藥系列、季德勝蛇藥片等20多個(gè)國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)重要的主要原料藥。其供需矛盾尖銳、市場(chǎng)缺口巨大，導(dǎo)致野生資源遭遇掠奪式采挖，致使許多未達(dá)入藥年限的藥材資源被倉(cāng)促采挖，藥材質(zhì)量下降。再者，七葉一枝花的人工規(guī)?；N植業(yè)尚未形成規(guī)模[2-4]，種源多來自野生混雜群體，在全國(guó)多數(shù)地區(qū)為從當(dāng)?shù)厣缴弦吧苯硬赏谝圃裕捎谝吧L(zhǎng)年限不一，難以對(duì)栽培效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，種苗的混亂不堪更加劇了藥材質(zhì)量的參差不齊。

對(duì)于多年生重樓來講，其藥材質(zhì)量受品種、產(chǎn)地和采收年限等多種因素的影響，已有研究證實(shí)隨生長(zhǎng)年限的增加，滇重樓地下根莖中甾體皂苷的含量呈現(xiàn)總體升高的趨勢(shì)[5-7]。而對(duì)七葉一枝花植株性狀、根系發(fā)育、產(chǎn)量及皂苷成分含量動(dòng)態(tài)研究尚不清楚，因此合理的采收年限尚不能確定。四川的龍門山脈地區(qū)是七葉一枝花的主產(chǎn)區(qū)，筆者在該地區(qū)構(gòu)建了七葉一枝花種質(zhì)資源圃，進(jìn)行了摸索性試驗(yàn)研究。用種子繁育出大量的實(shí)生苗，已經(jīng)連續(xù)進(jìn)行了8年，得到了1～8年生的七葉一枝花植株和材料。本試驗(yàn)研究用種子繁殖的七葉一枝花的植株、根系、產(chǎn)量和皂苷含量與其生長(zhǎng)年限的關(guān)系，明確七葉一枝花生長(zhǎng)趨勢(shì)曲線，探明皂苷類化學(xué)成分含量是否受到生長(zhǎng)年限的影響，探索七葉一枝花最適宜的采收年限，為七葉一枝花規(guī)范化栽培的次生代謝調(diào)控與采收年限的確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材來源 在四川省彭州市七葉一枝花種植基地于2007—2014年連續(xù)8年進(jìn)行七葉一枝花實(shí)生苗的試驗(yàn)研究，實(shí)生苗經(jīng)四川大學(xué)生藥教研室張浩教授鑒定為七葉一枝花?；睾０胃叨? 020 m，位于103.930°E、30.980°N，土壤為黑壤土。栽培過程中進(jìn)行常規(guī)的田間管理。

1.1.2 儀器與試劑 島津LG-10A高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器；D1810D自動(dòng)純水蒸餾器。乙腈和甲醇均為色譜純，水為雙蒸水。重樓皂苷Ⅰ(111590-200402)、重樓皂苷Ⅱ(111591-200402)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷-3-O-β-D-葡萄糖(1→3)[α-L-鼠李糖(1→2)]-β-D-葡萄糖(PGGR)、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、纖細(xì)薯蕷苷和重樓皂苷Ⅴ這6個(gè)對(duì)照品都由筆者所在課題組提取分離所得，純度超過98%。

1.2 方法

1.2.1 植株形態(tài)、根系、單株產(chǎn)量數(shù)量性狀的測(cè)定 于2014年10月中旬七葉一枝花地上部分停止生長(zhǎng)后，在試驗(yàn)基地定株測(cè)定植株的株高、莖粗、葉片數(shù)、葉片長(zhǎng)和葉片寬；同時(shí)采集地下根莖，其中1年生七葉一枝花植株60株，2～8年生長(zhǎng)年限植株各30株，測(cè)定主根長(zhǎng)、根莖直徑、須根數(shù)、須根長(zhǎng)、須根寬、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等數(shù)量性狀。

1.2.2 藥材中皂苷類成分的測(cè)定 采集到的藥材低溫干燥后打粉過篩(40目)，應(yīng)用HPLC法進(jìn)行皂苷類成分的測(cè)定。色譜條件的確立、對(duì)照品和供試品溶液的制備、線性關(guān)系的考察、精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收試驗(yàn)、樣品測(cè)定的具體方法見陳鐵柱等介紹的方法[8]。藥材留樣憑證標(biāo)本存放于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院標(biāo)本室，所有樣品均有原植物數(shù)碼照片及原植物標(biāo)本。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 方差分析使用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)年限對(duì)七葉一枝花植株性狀的影響

不同生長(zhǎng)年限七葉一枝花的株高、莖粗、葉片數(shù)、葉片長(zhǎng)、葉片寬有顯著差異(圖1)。隨著年限的增長(zhǎng)，株高不斷增加；1～5年生的莖粗增粗明顯，隨后的3年增粗不明顯；葉片數(shù)隨著年限不斷增加，8年生葉片數(shù)平均達(dá)12.5張；葉片長(zhǎng)也在不斷增長(zhǎng)，其中1～4年生的葉片長(zhǎng)增長(zhǎng)明顯；葉片寬在 1～5年生間增寬明顯，隨后3年增寬不明顯。

2.2 不同生長(zhǎng)年限七葉一枝花的根系性狀分析

不同生長(zhǎng)年限七葉一枝花根系數(shù)據(jù)呈顯著差異(圖2)。隨著年限的增長(zhǎng)，主根長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng)，其中1年生和2年生、3年生和4年生、5年生和6年生、7年生和8年生的主根長(zhǎng)差異均不顯著，但是每相隔2年其主根長(zhǎng)差異均顯著；主根直徑隨著年限的增長(zhǎng)不斷增大，但5～8年的主根直徑增大差異不顯著；須根數(shù)逐漸增多，其中2年生與3年生、5年生和6年生、7年生和8年生的須根數(shù)差異不顯著；1～3年生的須根長(zhǎng)和須根直徑差異不顯著，須根直徑從4年生開始每相鄰的2年之間差異不顯著(6～7年生除外)。

2.3 不同生長(zhǎng)年限七葉一枝花的單株產(chǎn)量分析

不同生長(zhǎng)年限七葉一枝花的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、折干率、增質(zhì)量倍數(shù)均差異顯著(圖3)。1年生和2年生、3年生和4年生、6～8年生的鮮質(zhì)量差異不顯著，隨著年限的增長(zhǎng)，根莖鮮質(zhì)量在不斷增加。1～3年生的干質(zhì)量差異顯著，3年生和4年生、6～8年生的干質(zhì)量差異均不顯著，根莖干質(zhì)量不斷累積增長(zhǎng)。1～3年生的折干率差異顯著，隨后的5年折干率差異均不顯著。5年生的年增質(zhì)量倍數(shù)要顯著高于其他年生的增質(zhì)量倍數(shù)，達(dá)到7.1倍左右。

2.4 不同生長(zhǎng)年限七葉一枝花皂苷含量分析

不同年限的七葉一枝花藥材中的皂苷含量的測(cè)定結(jié)果見表1。1～8年生的七葉一枝花藥材中均沒有檢測(cè)到重樓皂苷Ⅰ；1～7年生七葉一枝花中均沒有檢測(cè)到皂苷Ⅱ、纖細(xì)薯蕷皂苷和重樓皂苷V，盡管8年生藥材中檢測(cè)到皂苷H、纖細(xì)薯蕷皂苷和重樓皂苷V，但含量甚微。從不同生長(zhǎng)年限藥材中的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓總皂苷含量變化曲線(圖4)可以看出，1～5年生的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓總皂苷含量呈現(xiàn)逐年下降的趨勢(shì)；5～8年生的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓總皂苷含量逐年上升。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同生長(zhǎng)年限的七葉一枝花植株性狀、根系性狀、單株產(chǎn)量分析

七葉一枝花作為歷版《中國(guó)藥典》收載的法定品種，但研究相對(duì)較少，前人研究基礎(chǔ)薄弱。七葉一枝花是多年生植物，植株生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)，研究周期也比較長(zhǎng)[9-10]。同時(shí)七葉一枝花種子具有生理后熟和形態(tài)后熟的特征，自然條件下至少2年后才能發(fā)芽，而且出苗后當(dāng)年幼苗會(huì)長(zhǎng)出主根和萌發(fā)的芽鞘，葉片也只有1張，要用于大田栽培至少要等到出苗后2～3年，可見育苗周期長(zhǎng)。因此，現(xiàn)有關(guān)七葉一枝花的實(shí)生苗的相關(guān)報(bào)道非常有限。本試驗(yàn)對(duì)用種子繁殖的1～8年不同生長(zhǎng)年限的七葉一枝花植株進(jìn)行了研究，得到了1～8年的生長(zhǎng)變化曲線。結(jié)果顯示，隨著年限的增長(zhǎng)，七葉一枝花植株性狀、根系性狀、單株產(chǎn)量數(shù)據(jù)呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。其中，5年生的七葉一枝花單株質(zhì)量增質(zhì)量倍數(shù)要顯著高于其他年生，達(dá)到7.1倍左右，說明種植后5年是七葉一枝花快速生長(zhǎng)期。

但6、7、8年生之間的莖粗、葉片寬、主根直徑、須根數(shù)和須根長(zhǎng)之間的差異不顯著，尤其是7年生和8年生植株的株高、莖粗、葉片數(shù)、葉片長(zhǎng)、葉片寬、主根長(zhǎng)、根莖直徑、須根數(shù)、須根長(zhǎng)、須根寬、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量沒有顯著差異。說明從種植后6年開始，七葉一枝花植株生長(zhǎng)開始放緩，尤其在7年生和8年生表現(xiàn)得更為明顯， 其8年生七葉一枝花平均每株干質(zhì)量達(dá)到23.1 g，其質(zhì)量與中藥材市場(chǎng)上流通的中小規(guī)格的重樓質(zhì)量相近。因此，用種子繁殖的實(shí)生苗，可在種植6年后進(jìn)行采收。同時(shí)，建議繼續(xù)深度開展七葉一枝花根莖種苗繁育及栽培技術(shù)研究，進(jìn)行更長(zhǎng)生長(zhǎng)年限的研究，確定其更完善的技術(shù)體系，從而保障七葉一枝花栽培的技術(shù)的成熟度，實(shí)現(xiàn)規(guī)范化栽培。

表1 不同生長(zhǎng)年限對(duì)七葉一枝花8種重樓皂苷含量的影響

3.2 不同生長(zhǎng)年限的七葉一枝花藥材中的皂苷種類和含量分析

生長(zhǎng)年限為影響七葉一枝花藥材質(zhì)量的重要因素之一，搞清楚七葉一枝花化學(xué)成分含量隨年限的變化規(guī)律，對(duì)其合理采收種植有很大意義。本研究連續(xù)測(cè)定了1～8年生的七葉一枝花藥材中的皂苷類成分含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)年限的七葉一枝花中重樓皂苷主要以偏諾皂苷為主，幾乎沒有檢測(cè)到薯蕷皂苷成分重樓皂苷Ⅱ、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅴ。整體上看，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓總皂苷含量呈現(xiàn)一個(gè)大致“V”字形的變化趨勢(shì)，即1～5年生重樓皂苷含量逐年下降，可能由于這5年屬于七葉一枝花的快速生長(zhǎng)期(從單株根莖干質(zhì)量的增質(zhì)量比率也可以看出是快速增長(zhǎng)期)，隨年限的增長(zhǎng)，體內(nèi)積累淀粉等物質(zhì)呈倍數(shù)顯著增長(zhǎng)，從而導(dǎo)致其皂苷含量逐漸降低；從種植后5年開始，根莖干質(zhì)量增質(zhì)量倍數(shù)降低，體內(nèi)淀粉等物質(zhì)含量增速放緩，從而導(dǎo)致其皂苷含量逐漸升高。

七葉一枝花的皂苷類成分含量隨生長(zhǎng)年限的變化而變化，大部分皂苷類含量并不是隨著生長(zhǎng)年限的增長(zhǎng)而不斷增加，6年生的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓皂苷總含量反而不如4年生，從這個(gè)角度看4年生七葉一枝花質(zhì)量較6年生更好。所以，從質(zhì)量角度來講，并不是生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)越好。所有生長(zhǎng)年限的藥材樣品中，均檢測(cè)到重樓皂苷Ⅶ和重樓皂苷H，作為《中國(guó)藥典》考察的成分指標(biāo)重樓皂苷Ⅶ，其含量從種植后1年一直連續(xù)下降到種植后4年，從種植后5年開始連續(xù)上升到種植后8年，種植8年之后是否還會(huì)繼續(xù)上升有待于進(jìn)一步研究。

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