尤莉艷， 楊 婷， 姜 輝， 馬朝紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院長白山動(dòng)植物利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林 132101； 2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院文理學(xué)院，吉林吉林 132101)

細(xì)葉杜香(LedumpalustreL. var.angustumE. Busch)，別稱喇叭茶，是杜鵑花科杜香屬常綠小灌木。我國野生杜香資源豐富，主要分布于我國大小興安嶺、內(nèi)蒙古和長白山地區(qū)。文獻(xiàn)報(bào)道杜香屬植物含有豐富的揮發(fā)油、黃酮類和萜類等化合物[1-2]。杜香的枝、葉、花和果實(shí)均可提取出芳香揮發(fā)油，其中花、果出油率較高。杜香揮發(fā)油成分的功效已被運(yùn)用于日常生活、醫(yī)療、香料生產(chǎn)等領(lǐng)域，如杜香揮發(fā)油可以擴(kuò)張血管、降低血壓、鎮(zhèn)咳平喘、治療胃潰瘍和月經(jīng)不調(diào)，同時(shí)在殺菌、祛除腳氣和治療皮膚瘙癢等方面也有顯著的治療效果[1-3]。

目前，提取天然產(chǎn)物的方法主要有水蒸汽蒸餾法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法等。超聲波獨(dú)具的極端物理特性及其產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)可促使植物組織破壁或變形，使有效成份提取得更充分，可以提高細(xì)胞破碎度和有效成分的提取率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，杜香花蕾中含揮發(fā)油15%～20%[4-5]，而目前生產(chǎn)上杜香揮發(fā)油的莖和葉提取率不高[6-7]，且關(guān)于提取工藝優(yōu)化的研究較少。因此，本研究設(shè)計(jì)以杜香揮發(fā)油提取率為評價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)，對杜香枝葉揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer，簡稱GC-MS)分析技術(shù)對提取的杜香揮發(fā)油進(jìn)行了成分鑒定，以期為充分利用杜香資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料 采自黑龍江省塔河林業(yè)局，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校內(nèi)從事藥用植物研究的孫倉教授鑒定為杜鵑花科杜香屬植物細(xì)葉杜香。

1.1.2 主要試劑 無水乙醇(A.R.)，由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器 GC-MS色譜儀(型號為QP2010 Ultra)，購自日本島津公司；電子分析天平(型號為ME203E)，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；數(shù)控超聲波清洗器(型號為KQ-100DE)，購自昆山市超聲儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號為HH-12)，購自上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號為DHG-9030)，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；粉碎機(jī)(型號為HK200)，購自廣州華凱機(jī)電設(shè)備有限公司；標(biāo)準(zhǔn)分樣篩(型號為304)，購自浙江省紹興市上虞區(qū)華豐五金儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 杜香揮發(fā)油的提取 取用的材料為新鮮的杜香莖和葉，將杜香的莖用剪刀剪成3 cm左右裝入燒杯中，然后反復(fù)用自來水清洗，直到潔凈為止，再用蒸餾水清洗，置于60 ℃烘箱中烘干，然后用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩。

杜香揮發(fā)油提取率=杜香揮發(fā)油質(zhì)量/杜香粗粉質(zhì)量×100%。

1.2.2 杜香揮發(fā)油提取的單因子試驗(yàn)

1.2.2.1 提取溶劑濃度的篩選 精確稱量研磨后的杜香粉末5 g，共5份，設(shè)定超聲時(shí)間為15 min，超聲功率為50 kHz，超聲溫度為60 ℃，料液比為1 g ∶15 mL，分別用30%、40%、50%、60%、70%乙醇提取杜香揮發(fā)油，通過比較揮發(fā)油的提取率，確定合適的乙醇濃度。

1.2.2.2 提取溫度的篩選 精確稱量研磨后的杜香粉末 5 g，共5份，設(shè)定超聲時(shí)間為15 min，超聲功率為50 kHz，料液比為1 g ∶15 mL，乙醇濃度為50%，設(shè)定提取溫度分別為30、45、60、75、90 ℃，通過比較揮發(fā)油的提取率，確定合適的提取溫度。

1.2.2.3 料液比的篩選 精確稱量研磨后的杜香粉末5 g，共5份，設(shè)定超聲功率為50 kHz，超聲溫度為60 ℃，超聲時(shí)間為15 min，乙醇濃度為50%，將料液比分別設(shè)定為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30(g ∶mL)，通過比較揮發(fā)油的提取率，確定合適的料液比。

1.2.2.4 提取時(shí)間的篩選 精確稱量研磨后的杜香粉末 5 g，共5份，設(shè)定超聲功率為50 kHz，超聲溫度為60 ℃，料液比為1 g ∶15 mL，乙醇濃度為50%，分別超聲提取5、10、15、20、25 min，通過比較揮發(fā)油的提取率，確定合適的超聲時(shí)間。

1.2.3 杜香揮發(fā)油提取的正交試驗(yàn) 選取乙醇濃度、超聲溫度、料液比、超聲時(shí)間等4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，采用L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，對超聲提取杜香揮發(fā)油的條件進(jìn)行優(yōu)化。L9(34)正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 杜香揮發(fā)油的成分分析 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對超聲波法提取的杜香揮發(fā)油成分進(jìn)行分析。

1.2.4.1 氣相色譜條件 色譜柱型號為Rxi-5MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為300 ℃；載氣為高純氦(99. 999%)；柱流速為1 mL/min；程序升溫，初始溫度為 60 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min的速度升至 300 ℃，保持5 min；進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比為100 ∶1。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源為電子轟擊(EI)源，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為300 ℃；掃描范圍為35～500m/z。利用NIST11.LIB標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)檢索，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜香揮發(fā)油提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對杜香揮發(fā)油提取率的影響 由圖1可知，乙醇濃度從30%增大到70%，杜香揮發(fā)油提取率隨著乙醇濃度的增大呈先增加后減小的趨勢。其中，乙醇濃度從30%增大到40%時(shí)，提取率上升趨勢明顯，乙醇濃度從40%增大到50%，提取率變化不明顯。乙醇濃度從50%增大至70%，提取率明顯下降。由于乙醇濃度的增大會使一些醇溶性色素、親脂性強(qiáng)的成分及雜質(zhì)的溶出量增加，且溶劑濃度增加可引起提取成本增加，因此選用濃度40%、50%、60%的乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度對杜香揮發(fā)油提取率的影響 由圖2可知，溫度較低時(shí)，杜香揮發(fā)油提取率較低，其原因可能是低溫不利于超聲波的空化作用。提取溫度從30 ℃升高到75 ℃，杜香揮發(fā)油的提取率呈明顯上升趨勢，且當(dāng)提取溫度為75 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值。超聲溫度從75 ℃升高到90 ℃，杜香揮發(fā)油提取率隨著溫度的升高明顯降低，其原因可能是高溫條件下杜香揮發(fā)油的穩(wěn)定性差，杜香揮發(fā)油發(fā)生分解，導(dǎo)致提取率降低。因此，選用45、60、75 ℃的超聲溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 料液比對杜香揮發(fā)油提取率的影響 由圖3可知，杜香的提取率隨著料液比的增大而增加，所以料液比的增大有利于杜香揮發(fā)油提取率的提高。當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶30 mL時(shí)，提取率達(dá)到最大值。料液比從1 g ∶25 mL增大到 1 g ∶30 mL，杜香揮發(fā)油提取率的增加趨勢不明顯，考慮到節(jié)約溶劑，避免不必要的浪費(fèi)和污染，選用1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25(g ∶mL)的料液比進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4 提取時(shí)間對杜香揮發(fā)油提取率的影響 由圖4可知，超聲時(shí)間從5 min延長到25 min，提取率提高，且當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，提取率最高，說明適當(dāng)延長提取時(shí)間，有利于杜香揮發(fā)油的溶出，進(jìn)而提高提取率?？紤]到超聲時(shí)間為15～25 min時(shí)，提取率無明顯差異，因此為節(jié)約時(shí)間和能源，縮短提取周期，選擇10、15、20 min的超聲時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 杜香揮發(fā)油提取的正交試驗(yàn)

由表2可知，各因素對杜香提取率的影響程度表現(xiàn)為乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間>料液比，其中乙醇濃度為主要因素，提取溫度和提取時(shí)間次之，料液比的影響最小，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析最佳提取工藝，二者最佳工藝條件不吻合，所以，將正交試驗(yàn)條件(A2B3C1D2)和極差分析條件(A2B3C3D2)進(jìn)行比較， 結(jié)果見表3， 按照極差分析得到的工藝條件的提取率均高于按照正交試驗(yàn)的最高提取率。因此，超聲提取杜香揮發(fā)油的最佳工藝條件為A2B3C3D2，即乙醇濃度50%，提取溫度75 ℃，料液比1 g ∶25 mL，超聲時(shí)間 15 min。此外，為驗(yàn)證最佳工藝條件，在A2B3C3D2條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，杜香揮發(fā)油的平均提取率為8.49%。

表2 杜香揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 杜香揮發(fā)油提取驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

注：RSD表示相對平均偏差。

2.3 杜香揮發(fā)油的成分分析

對杜香揮發(fā)油提取物進(jìn)行GC-MS分析，由圖5可知，由超聲提取法得到50多個(gè)峰，從中鑒定出27種化合物，占總峰面積的72.70%，所鑒定的化合物相似度均≥90%，對于相似度較低或者檢索結(jié)果不符合出峰及質(zhì)譜斷裂規(guī)律的物質(zhì)，未進(jìn)行分析和討論。鑒定出的杜香揮發(fā)油主要成分及其相對含量見表4。結(jié)果表明，杜香揮發(fā)油的主要成分有萜類、芳香烴、烯烴、醇、酮和酯類化合物，其中含量較高的化合物有桃金娘烯醛、甲基異丙基苯、4-萜烯醇、枯茗醛、枯茗醇、β-水芹烯、γ-松油烯等。

3 結(jié)論

在超聲波法提取杜香揮發(fā)油的試驗(yàn)中，選用溶劑濃度、提取溫度、料液比和提取時(shí)間作為考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，影響杜香揮發(fā)油提取率的主要因素為溶劑濃度，其次是提取溫度和提取時(shí)間，料液比影響最小。確定最佳提取工藝條件為A2B3C3D2，即乙醇濃度50%，提取溫度75 ℃，料液比1 g ∶25 mL，提取時(shí)間15 min，經(jīng)試驗(yàn)證明，利用此方法提取杜香揮發(fā)油的平均提取率可達(dá)到8.49%。此外，通過 GC-MS 分析杜香揮發(fā)油的成分發(fā)現(xiàn)，其主要成分為萜類、芳香烴、烯烴、醇、酮和酯類化合物等，其中含量較高的化合物有桃金娘烯醛、甲基異丙基苯、4-萜烯醇、枯茗醛、枯茗醇、β-水芹烯、γ-松油烯等。

表4 杜香揮發(fā)油的化學(xué)成分分析結(jié)果

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