杜志國,張廷榮,宋俊霖,黃 凱,王 森,張麗萍,溫奇鳳,項(xiàng)露娟,郭 穎,尹燕博

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東 青島 266109;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266200;4.青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,山東 青島 266200;5.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院輸血科 ,遼寧 沈陽 110000)

比格犬被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域[1]。目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究人員已對(duì)比格犬的能量、蛋白需求[2-3],主要器官系數(shù)[4],心電圖[5-6]等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)做了詳細(xì)測定,但對(duì)比格犬紅細(xì)胞壓積、脆性的報(bào)道較少。隋麗華、王冬平等對(duì)8月齡以下的比格犬的紅細(xì)胞壓積做了詳細(xì)分析[7-8]。到目前為止,國內(nèi)尚未見對(duì)15月齡以上的比格犬的紅細(xì)胞壓積、脆性進(jìn)行測定的報(bào)道。本次測定選取不同年齡段健康比格犬,對(duì)紅細(xì)胞壓積、脆性的數(shù)值進(jìn)行準(zhǔn)確檢測,并分析其變化規(guī)律。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡、6月齡、8月齡、1 ～8 歲齡健康比格犬(Covance中體型)120只,3月齡組20只,其余每個(gè)年齡組10只,體重相近,雌雄各半,均由青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。根據(jù)生長階段分為幼年犬(3月齡)、育成犬(6～8月齡)、成年犬(1～6歲齡)、老年犬(7～8歲齡)4組。

1.1.2儀器與試劑 EDTA-K2抗凝管、肝素鈉抗凝管,山東天愛醫(yī)療器械有限公司;Junior Vet 5血細(xì)胞分析儀,蘭橋康泰醫(yī)學(xué)科技有限公司;318C+酶標(biāo)儀,上海沛歐分析儀器有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)板,Costar公司;自配置梯度鹽水。

1.2方法

1.2.1配置梯度鹽水 鹽水梯度見表1。

1.2.2樣品采集 每只比格犬在相同時(shí)間段于前肢內(nèi)側(cè)靜脈處采集血液,采集4 mL分別放入兩種抗凝管,各2 mL,均在6 h內(nèi)處理樣品。

1.2.3樣品的測定 將EDTA-K2抗凝管內(nèi)的血液輕輕混勻,利用血細(xì)胞分析儀測定紅細(xì)胞壓積;將各個(gè)梯度的鹽水分別依次加入5 mL離心管中,每管2.5 mL,并將生理鹽水與蒸餾水各2.5 mL分別加入額外的兩個(gè)5 mL離心管中做陰性對(duì)照與陽性對(duì)照,每組均設(shè)陰性對(duì)照與陽性對(duì)照,然后將肝素鈉抗凝管內(nèi)的血液輕輕混勻,向離心管中依次加入50 μL血液,輕輕混勻。在室溫下靜置1 h后,用移液槍小心的吸取每個(gè)離心管液面的液體100 μL,加入細(xì)胞培養(yǎng)板中,放入酶標(biāo)儀總測定在570 nm波長下的吸光度值[9]。將各孔中液體在570 nm時(shí)的吸光度值(OD值)進(jìn)行記錄。液體中血紅蛋白濃度越高,OD值越大,當(dāng)紅細(xì)胞完全溶解時(shí),梯度鹽水間OD值趨于穩(wěn)定并近似于陽性對(duì)照。OD值開始升高時(shí)為開始溶血,其NaCl濃度為最小抵抗值,OD值趨于穩(wěn)定并近似于陽性對(duì)照時(shí)為完全溶血,其最高NaCl濃度為最大抵抗值,記錄最小抵抗值和最大抵抗值的鹽水濃度。

表1　鹽水梯度

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析 采用 SPSS22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1紅細(xì)胞壓積結(jié)果分析 比格犬的紅細(xì)胞壓積隨著年齡的增長,呈現(xiàn)先增長,再降低的情況;但不同性別比格犬的紅細(xì)胞壓積變化又存在一定差異,公犬的紅細(xì)胞壓積在4歲前隨年齡逐漸上升,于4～6歲時(shí)達(dá)到最大值并呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài),隨后于7歲時(shí)降低;母犬的紅細(xì)胞壓積在5歲前隨年齡逐步上升,于5歲時(shí)達(dá)到最大值,隨后下降(見中插彩版圖1)。

將所有比格犬按生長階段、性別分組,分別對(duì)相應(yīng)分組犬的紅細(xì)胞壓積進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析(表3)。結(jié)果顯示,成年犬紅細(xì)胞壓積分別大于幼年犬,差異顯著(P＜0.01,F=4.102,df=68)、育成犬,差異顯著(P＜ 0.01,F=0.354,df=78)、老年犬,差異顯著(P＜ 0.05,F=0.069,df=78);老年犬紅細(xì)胞壓積分別大于幼年犬,差異顯著(P＜0.01,F=4.869,df=28)、育成犬,差異顯著(P＜0.01,F=0.563,df=38);育成犬紅細(xì)胞壓積大于幼年犬,差異顯著(P＜0.01,F=3.42,df=28);成年公犬紅細(xì)胞壓積大于母犬,差異顯著(P＜0.05,F=2.047,df=58),其他各組內(nèi)公、母犬之間紅細(xì)胞壓積無顯著差異(表2)。

表2　不同生長階段及性別紅細(xì)胞壓積的參考值

2.2紅細(xì)胞脆性結(jié)果分析 紅細(xì)胞脆性與年齡之間暫無變化規(guī)律可循。將所有比格犬按生長階段、性別分組,分別對(duì)相應(yīng)分組犬的紅細(xì)胞脆性進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析(表5)。結(jié)果顯示,紅細(xì)胞脆性幼年犬與育成犬的最大抵抗值差異顯著(P＜0.05,F=0.662,df=28),最小抵抗值差異不顯著,幼年犬與成年犬最小抵抗值差異顯著(P＜0.05,F=1.756,df=68),最大抵抗值差異不顯著,幼年犬與老年犬最小抵抗值和最大抵抗值差異都不顯著;育成犬與成年犬的最大抵抗值與最小抵抗值差異都不顯著;育成犬與老年犬的最大抵抗值差異顯著(P＜ 0.05,F=4.857,df=34.299),最小抵抗值差異不顯著;成年犬與老年犬的最大抵抗值差異顯著(P＜0.05,F=0.055,df=78),最小抵抗值差異不顯著;成年公、母犬之間紅細(xì)胞脆性最大抵抗值差異顯著(P＜0.05,F=0.031,df=58),最小抵抗值差異不顯著;其余各組公母犬紅細(xì)胞脆性差異不顯著(表3)。

表3　不同生長階段及性別紅細(xì)胞脆性的參考值

3　討論

不同種系、飼養(yǎng)環(huán)境、設(shè)施的變化會(huì)直接影響到比格犬的生理指標(biāo),使比格犬的基本生物學(xué)數(shù)據(jù)存在一定的差別[10]。隋麗華、王冬平等人檢測某封閉群比格犬紅細(xì)胞壓積的結(jié)果顯示[7-8],6月齡、8月齡比格犬的紅細(xì)胞壓積分別為34.43±8.16(%)和39.19±14.18(%),4～8月齡的比格犬紅細(xì)胞壓積隨著年齡增長逐漸升高;本次測定發(fā)現(xiàn)6月齡和8月齡比格犬的紅細(xì)胞壓積分別為42.35±2.80(%)和45.40 ±1.81(%),雖然相似月齡的紅細(xì)胞壓積存在差異,但其變化規(guī)律與二人數(shù)值的變化規(guī)律相符。成年后比格犬紅細(xì)胞壓積的數(shù)據(jù)較少,暫未發(fā)現(xiàn)對(duì)比的數(shù)值。

成年犬的紅細(xì)胞壓積大于幼年犬、育成犬與老年犬的情況,與人類紅細(xì)胞壓積參考值的變化情況相似[11-13]。母犬的紅細(xì)胞壓積在6歲齡時(shí)下降,公犬在7歲齡時(shí)下降,應(yīng)與隨著年齡的增長,激素水平、身體機(jī)能下降有關(guān)。有研究表明,雄激素有刺激紅細(xì)胞生成素(EPO)的合成與釋放的作用,也有改善骨髓對(duì)EPO的反應(yīng)性的作用。EPO是一種物理化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定的糖蛋白,與紅系祖細(xì)胞(CFUE)受體結(jié)合后能使其增值分化,并顯著減慢CFUE脫氧核糖核酸(DNA)降解速率,抑制CFU-E凋亡,CFU-E能促進(jìn)紅細(xì)胞成熟,是紅系造血的主要調(diào)節(jié)因子[13]。紅細(xì)胞壓積在公、母犬幼年時(shí)無明顯差異,但成年時(shí)公犬大于母犬,與相關(guān)研究的情況相符。

本次測定不但檢測了幼年犬和育成犬的紅細(xì)胞壓積,還檢測了成年犬與老年犬的紅細(xì)胞壓積以及各生長階段的紅細(xì)胞脆性,并分析了其變化情況,豐富了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn):