雙重響應性POSS基嵌段共聚物的合成及其溶液自組裝行為的研究

孫曉晴,曹 杰,李紀錄,何鍇慰,許一婷,戴李宗

(廈門大學 材料學院,福建省防火阻燃材料重點實驗室,福建 廈門 361005)

人體中存在許多天然屏障保護機體不受侵害,但同時也給疾病的治療設置了障礙.聚合物納米粒子經(jīng)過適當?shù)男揎?可以跨越生物膜屏障,將藥物傳送到全身組織[1],同時還可利用機體病變部位環(huán)境因素的變化刺激對其具有響應性的聚合物納米粒子載體發(fā)生物理化學性質(zhì)變化,使藥物在特定部位釋放.響應性是聚合物納米粒子引人注目的特點之一[2],目前已有大量關(guān)于pH、溫度、光等刺激響應性藥物釋放體系的報道[3-5].而與傳統(tǒng)的單一響應性聚合物相比,多重響應性共聚物已成為一個重要的研究方向.Wei等[6]制備的三嵌段共聚物PEG45-B-PNIPAAm380-b-P(NIPAAm423-co-N-HEAAm42),分別在37和48 ℃顯示出低臨界溶解溫度(lower critical solution temperature,LCST),其組裝結(jié)構(gòu)可在膠束(37～45 ℃,約260 nm)和囊泡 (>50 ℃,約420 nm)之間轉(zhuǎn)化.Sahoo等[7]合成了一種溫度和pH雙重響應的核-殼納米顆粒,以刺激性聚合物為殼,磁性納米顆粒為核,可作為抗癌藥物強力霉素(DOX)的載體和癌細胞特異性靶向劑,結(jié)果表明DOX在所需的溶酶體pH和溫度條件下可優(yōu)先持續(xù)釋放.

多面體齊聚倍半硅氧烷(polyhedral oligomeric silsesquioxane,POSS)的化學分子通式為(RSiO1.5)8,R為氫原子或有機官能團,如脂肪族烷基、芳香族烴基、丙烯酸酯、羥基以及它們的衍生物.POSS分子籠形結(jié)構(gòu)的頂角硅原子可以連接有機取代基,有利于將無機雜化結(jié)構(gòu)引入大分子鏈中,賦予聚合物新的物理和化學性能,大大拓展了其應用范圍.POSS還具有低毒性和良好生物相容性等優(yōu)勢,可作為生物材料[8-9],并被廣泛研究.同時POSS的籠形立體結(jié)構(gòu)使得大分子之間的堆積不是很緊密,相對于一般雙親性嵌段共聚物,POSS 基嵌段共聚物具有更加穩(wěn)定的形態(tài),在高濃度下不易纏結(jié),稀釋也不易裂解.本研究利用POSS的強疏水性有助于形成穩(wěn)定內(nèi)核負載客體分子的特點,將其與溫度響應性N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)和pH響應性丙烯酸(AA)單體共聚,通過可逆加成-斷裂轉(zhuǎn)移聚合法(reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization,RAFT)制備了具有雙重響應性的POSS基嵌段共聚物,并研究了其在水中的自組裝行為、pH響應性和溫度響應性.

1 實驗部分

1.1 實驗原料

圖1 嵌段共聚物的合成Fig.1 Synthesis of block copolymers

甲基丙烯酰氧丙基七異丁基籠形倍半硅氧烷(MAPOSS,純度98%)購自Hybrid Plastic公司.2-苯基-2-丙基苯并二硫(CDB,純度99%)、NIPAM (純度99%)、丙烯酸叔丁酯(tBA,純度98%)、三氟乙酸(TFA,分析純)、偶氮二異丁腈(AIBN,分析純)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司.氫氧化鈉、無水乙醇、二氯甲烷、四氫呋喃(THF)均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司.高純氬氣(Ar,純度99.99%)購自林德公司.

1.2 合成方法

1.2.1 嵌段共聚物PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)的合成

以CDB作為鏈轉(zhuǎn)移劑,通過RAFT合成POSS基嵌段共聚物,反應過程如圖1所示:1) 依據(jù)文獻[10]所述方法,合成不同聚合度的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑PMAPOSS10、PMAPOSS15、PMAPOSS20;2) 分別以不同聚合度的PMAPOSS為大分子鏈轉(zhuǎn)移劑,AIBN作為引發(fā)劑,固定反應單體NIPAM和tBA的摩爾比，合成PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA)嵌段共聚物；3)將上述嵌段共聚物在添加TFA的條件下水解,得到PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)嵌段共聚物[11].其中PMAPOSS20-b-(PNIPAM50-co-PAA150)的合成步驟如下:將PMAPOSS20(0.957 g,0.05 mmol)、AIBN(1.64 mg,0.01 mmol)、NIPAM(0.283 g,2.50 mmol)和tBA(1.087 mL,7.50 mmol)溶于2 mL THF中,經(jīng)連續(xù)凍融脫氣3～5次,在65 ℃氬氣保護下反應54 h,經(jīng)液氮淬冷停止反應;選擇V(甲醇)∶V(水)=2∶1為沉淀劑,反復沉淀3次,真空干燥得到橘紅色固體,即PMAPOSS20-b-(PNIPAM50-co-PtBA150)；將PMAPOSS20-b-(PNIPAM50-co-PtBA150)(0.378 g,0.99 mmol tBA單元)加入到40 mL二氯甲烷中,攪拌15 min以溶解共聚物;然后快速滴入過量TFA(1.1 mL,14.85 mmol,15倍過量于AA單元),置于室溫下攪拌36 h;最后通過旋蒸除去二氯甲烷和TFA;產(chǎn)物用二氯甲烷洗滌3次,常溫下真空干燥得到淡黃色固體即為PMAPOSS20-b-(PNIPAM50-co-PAA150).按照所選大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的聚合度,將水解前的嵌段共聚物命名為Bt-10、Bt-15、Bt-20,水解后的嵌段共聚物則相應地命名為Ba-10、Ba-15、Ba-20.

1.2.2 共聚物膠束以及包覆芘的膠束溶液的制備

將5 mg PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)共聚物溶于1 mL THF中,然后將共聚物溶液逐滴加入到5 mL蒸餾水中,在常溫下敞口靜置,待THF 完全揮發(fā)后得到共聚物膠束溶液,取樣進行測試.以丙酮為溶劑配制芘丙酮溶液(0.05 mg/mL),取預定體積的溶液與5 mL 1 mg/mL的共聚物母液(以THF為溶劑配制)混合,將混合溶液逐滴加入到5 mL的蒸餾水中,在通風櫥中靜置，待丙酮和THF完全揮發(fā)后,即可獲得包覆芘的膠束溶液(1 mg/mL),取樣進行后續(xù)測試.

1.3 測試與表征

采用Nicolet Avatar 360紅外光譜儀,全反射模式(ATR)測定傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜.采用Bruker AV 400核磁共振波譜(NMR)儀(400 MHz)，CDCl3作為溶劑,四甲基硅烷(tetramethylsilane,TMS)為內(nèi)標測定1H-NMR.超高效聚合物色譜(APC)測試數(shù)據(jù)采用PSS Win GPC系統(tǒng)采集,THF為流動相,甲苯為內(nèi)標,25 ℃,流速0.5 mL/min.采用Malvern公司的Nano ZS粒徑分析儀,500 nm波長散射角度為90°的氬離子激光器(400 mW)進行膠束溶液的動態(tài)光散射(DLS)及Zeta電位的測試.采用JEM2100高分辨透射電子顯微鏡(TEM)觀察樣品微觀形貌,加速電壓為200 kV,樣品用200目銅網(wǎng)撈取,干燥后直接觀察.采用F7000型熒光分光光度計測定熒光光譜,激發(fā)狹縫寬度為2.5 nm,發(fā)射狹縫寬度為2.5 nm,掃描速率為240 nm/min.采用島津公司的UV-2550紫外-可見分光光度計測定膠束溶液在500 nm處的紫外光透過率.

2 結(jié)果與討論

2.1 嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)表征

圖2 PMAPOSS(A)、PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA)(B)和PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)(C)的1H-NMR譜圖Fig.2 1H-NMR spectra of PMAPOSS (A),PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA) (B) and PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA) (C)

用PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)譜圖中未水解的叔丁基質(zhì)子峰(δ=1.45)和Si—CH2(δ=0.6)特征峰的積分面積比代表未水解的tBA量(nr(tBA)),PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA)譜圖中相應積分面積比代表共聚物中tBA的總量(nt(tBA))，tBA水解率的計算公式如下:

η=[1-(nr(tBA)/nt(tBA))]×100%.

嵌段共聚物的合成及水解情況如表1所示.

2.2 嵌段共聚物的臨界膠束濃度(CMC)測定以及形貌表征

采用芘熒光探針光譜法測定嵌段共聚物的CMC[12].在室溫下芘的熒光光譜由5個振動帶組成,其中373和384 nm處譜帶的熒光強度I1和I3隨分子微環(huán)境的變化而變化，因此I3/I1常被用作檢測分子微環(huán)境極性的一個指標.測定不同濃度POSS基嵌段共聚物包芘溶液在373和384 nm處的熒光強度I1和I3,以嵌段共聚物濃度的對數(shù)(lgρ)為橫坐標,I3/I1為縱坐標作圖,所得擬合曲線的交點處所對應的濃度值即為嵌段共聚物的CMC.由圖4可得,Ba-10、Ba-15和Ba-20的CMC分別為3.6,3.0和2.3 mg/L.結(jié)果表明：CMC隨著嵌段共聚物結(jié)構(gòu)中PMAPOSS鏈段的增長而減小;Ba-10、Ba-15和Ba-20的CMC都很小,說明三者在很低的濃度下就可以獲得穩(wěn)定的膠束結(jié)構(gòu).

圖3 PMAPOSS，PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA)和PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA) 的FT-IR譜圖Fig.3 FT-IR spectra of PMAPOSS，PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA) and PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)

表1 嵌段共聚物的合成及水解結(jié)果

注：原料投料比n(NIPAM)∶n(tBA)∶n(PMAPOSS)∶n(AIBN)=50∶150∶1∶0.2;各鏈段聚合度采用1H-NMR法計算.

圖4 Ba-10、Ba-15和Ba-20的I3/I1值與溶液濃度對數(shù)的關(guān)系Fig.4 Relation between I3/I1 and lg ρ of Ba-10,Ba-15 and Ba-20

圖5(A)～(C)為Ba-20在水中自組裝所得膠束的TEM圖，可以直觀地觀察到Ba-20在水溶液中能形成結(jié)構(gòu)較為規(guī)整且穩(wěn)定的膠束,并表現(xiàn)出明顯的核-殼結(jié)構(gòu).圖5(D)為膠束溶液的DLS測試結(jié)果,可以看出Ba-10、Ba-15和Ba-20在水溶液中自組裝形成的膠束尺寸分別為為161,183和205 nm,多分散系數(shù)(PDI)為0.083,0.191和0.139.其中,Ba-15的PDI較Ba-10和Ba-20大很多,這可能是因為Ba-15中PNIPAM和PAA鏈段的長度比為34∶101=1∶2.97,是3種嵌段共聚物中PAA鏈段所占比例最低的(Ba-10和Ba-20中PNIPAM和PAA鏈段長度比值分別為1∶3.07和1∶3.19)；而隨著PAA鏈段比例的降低,形成膠束的PAA鏈段排斥力降低,疏水性下降,更多的嵌段共聚物可以締合在一起形成尺寸更大的膠束,組裝的可控性變差,導致得到的膠束尺寸不均一.

圖5 Ba-20膠束的TEM圖(A～C)和Ba-10,Ba-15,Ba-20膠束的DLS結(jié)果(D)Fig.5 TEM images of Ba-20 micelle (A-C),and DLS results of Ba-10,Ba-15,Ba-20 micelles (D)

2.3 嵌段共聚物的pH響應行為

圖6 嵌段共聚物膠束的粒徑(A)和溶液透光率(B)隨pH的變化曲線Fig.6 Variation curves of block copolymer micelle size (A) and transmittance of block copolymer micelles solution (B) with pH

嵌段共聚物膠束溶液粒徑隨pH的變化情況如圖6(A)所示,pH由10.0下降到4.0的過程中,膠束粒徑變化不大,在200 nm左右波動;但是,當pH小于3.0時,粒徑明顯增大,甚至增加到3 μm左右;從圖6(A)的插圖可以看出,膠束粒徑在顯著增大之前有一段小范圍內(nèi)的下降,這可能是因為:在pH較大時,膠束中殼層的PAA鏈段的羧基變成羧基陰離子,鏈段親水性增強,分子鏈段變得較為伸展,電離程度不同,鏈段之間的排斥力也有所不同,但對膠束的整體形態(tài)影響不大,只是尺寸發(fā)生少許變化,粒徑較為穩(wěn)定;而隨著pH的下降,羧基陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)轸然?鏈段疏水性增強,PAA鏈段之間的靜電斥力減小,鏈段由原來的伸展狀態(tài)變?yōu)轵榭s狀態(tài),膠束粒徑會有下降的趨勢,但是因為PAA中的羧基可以和PNIPAM中的酰胺基團發(fā)生分子鏈內(nèi)或分子鏈間的氫鍵絡合作用,使膠束聚集在一起,甚至可能生成沉淀,導致膠束粒徑急劇增大.而3種嵌段共聚物中Ba-20的PAA鏈段比例最大,表現(xiàn)出最強的pH響應性,膠束粒徑在pH較大時發(fā)生突變;Ba-10和Ba-15隨pH的增大粒徑的變化趨勢相差不大.圖6(B)為室溫下1 mg/mL嵌段共聚物膠束溶液的透光率隨pH的變化曲線.在pH 3.0～10.0范圍內(nèi)溶液透光率隨著溶液pH的升高而增加,其中在pH 3.0～5.0范圍內(nèi)增加很明顯,該變化趨勢與DLS的測試結(jié)果相符.pH為1.0時透光率較高，這是由于此時嵌段共聚物納米粒子發(fā)生聚集而沉淀,DLS的測試結(jié)果也顯示此時粒徑為微米級.

圖7 嵌段共聚物膠束的Zeta電位隨pH(A)及溫度(B)的變化曲線Fig.7 Variation curves of Zeta potential of block copolymer micelles with pH (A) and temperature (B)

圖7(A)顯示了在25 ℃下Ba-10、Ba-15和Ba-20在不同pH下的Zeta電位值,總體上是隨著pH的增大而減小.Ba-20、Ba-10和Ba-15 3種嵌段共聚物中n(AA)∶n(NIPAM)=3.19,3.07,2.97.由圖可見,嵌段共聚物分子鏈中PAA鏈段的比例越大,Zeta電位隨pH的變化速率越快,嵌段共聚物的等電點越小,依次為1.85,1.97和2.08.Zeta電位的變化趨勢和PAA的電離程度有很大關(guān)系,當pH為等電點時,膠束表面基本上不帶電荷,當pH增大時PAA電離程度加大,共聚物帶上負電荷,Zeta電位變?yōu)樨撝?當pH增大到一定程度后,Zeta電位的降低變得緩慢.而由圖7(B)可看出，隨著溫度的改變,嵌段共聚物的Zeta電位變化不大,說明溫度改變對嵌段共聚物的pH響應性影響不大.Zeta電位隨溶液pH的變化進一步驗證了上述嵌段共聚物對pH響應性原理的推論.

圖8 不同pH下包芘共聚物膠束對芘的釋放比例隨時間的變化曲線Fig.8 Variation curves of pyrene release percentage of pyrene-copolymer micelles with time under different pH

圖8為不同pH下包芘共聚物膠束對芘的釋放比例隨時間的變化曲線.在pH=6.58時隨時間延長其熒光強度(I3)下降很慢;當pH下降至5.02時,其熒光強度在30 min內(nèi)就下降很多.這可能是因為在pH較小時,PAA鏈段疏水性增強,膠束收縮使得核內(nèi)包裹的芘釋放到溶液中;相反地,在較高pH下,共聚物中羧基陰離子使分子鏈之間靜電排斥力增大,鏈段在溶液中伸展,形成穩(wěn)定膠束,同時能穩(wěn)定負載芘.在pH=5.02時,Ba-10和Ba-15包芘共聚物膠束在2 h內(nèi)對芘的釋放就基本達到了平衡,而Ba-20達到平衡的時間為4 h;且Ba-20對芘的釋放速率低于Ba-10和Ba-15,原因是Ba-20包芘共聚物膠束擁有較大的疏水核,雖然能包覆更多芘,但是同時芘釋放到外部環(huán)境中所要經(jīng)過的“通道”也更長.從圖中還可以看出,相比于在pH=6.58時,3種嵌段共聚物對芘的釋放比例在pH=5.02時短時間內(nèi)就能達到很高,這可能是因為質(zhì)子化的羧基與酰胺基的氫鍵絡合作用使膠束的穩(wěn)定性變差,有利于芘快速而大量的釋放.

2.4 嵌段共聚物的溫度響應行為

進一步研究了嵌段共聚物膠束的粒徑隨溫度的變化趨勢.將嵌段共聚物溶液的LCST定義為粒徑發(fā)生突變的起始點所對應的溫度.由圖9可知,在Ba-10、Ba-15和Ba-20的粒徑隨溫度變化曲線中,粒徑有明顯的突變階段,突變點所對應的溫度分別為35,30 和15 ℃.PNIPAM表現(xiàn)出溫度敏感性的原因主要是氫鍵作用和疏水作用：當溫度低于LCST時,分子中的酰胺基團可與水分子形成氫鍵,嵌段共聚物的溶解性增加,PNIPAM鏈段得以舒展,呈無規(guī)線團狀;而當溫度升到LCST及以上時,酰胺鍵與水分子之間的氫鍵被破壞,PNIPAM鏈段表現(xiàn)為疏水性,嵌段共聚物膠束粒徑變小.疏水鏈段比例的提高可降低溫敏性共聚物的LCST,甚至可能使共聚物的LCST消失[13-14].Ba-10的LCST高于Ba-15,可能是因為Ba-10中的強疏水性單元MAPOSS比例較小;在Ba-20中強疏水性單元MAPOSS是3種嵌段共聚物中所占比例最大的,導致Ba-20的LCST最低.

圖9 嵌段共聚物膠束粒徑隨溫度的變化曲線Fig.9 Variation curves of block copolymer micelle size with temperature

圖10 不同溫度下包芘共聚物膠束對芘的釋放比例隨時間的變化曲線Fig.10 Variation curves of pyrene release percentage of pyrene-copolymer micells with time at different temperature

圖10為27,32和37 ℃下,Ba-10、Ba-15和Ba-20的包芘共聚物膠束對芘的釋放比例隨著時間的變化曲線,可以看出,Ba-10包芘共聚物膠束在37 ℃時對芘的釋放比例明顯高于在27和32 ℃時;而Ba-15在32和37 ℃時對芘的釋放比例都明顯高于27 ℃時;Ba-20在3種不同溫度下對芘的釋放比例相差不大.由圖10得到的結(jié)果和3種嵌段共聚物的LCST相符.

在常溫下,芘通過擴散效應釋放到外部環(huán)境中,膠束內(nèi)外芘的含量差為芘釋放動力;同時芘被包裹在疏水核中,擴散到溶液中需要克服疏水內(nèi)核對芘的作用,并且需要通過膠束的核-殼界面以及親水性殼層.當溫度上升至LCST以上時,膠束表面的親水殼層的親水性下降,且膠束內(nèi)核因為表面殼層的坍塌而收縮變緊,這樣就使得芘通往外界的路徑縮短,核內(nèi)的芘被排擠出來,釋放到外部溶液中.

3 結(jié) 論

本研究采用RAFT成功制備了具有雙重響應的POSS基三元嵌段共聚物,并利用DLS、FT-IR、紫外-可見吸收光譜以及熒光光譜等測試手段研究嵌段共聚物在水中的自組裝行為與pH響應性和溫度響應性.通過改變環(huán)境的pH、溫度可以有效地控制合成的共聚物膠束的尺寸和穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)對疏水客體分子的控釋作用,特別是在酸性介質(zhì)中,客體分子能夠快速地釋放.此外，嵌段共聚物中疏水鏈段與親水鏈段的比例也會影響其CMC及膠束粒徑的尺寸,親水鏈段比例越大,越有利于客體分子的釋放.上述嵌段共聚物納米粒子的響應特性,使其可作為潛在的藥物輸送載體.

[1] FENART L,CASANOVA A,DEHOUCK B,et al.Evaluation of effect of charge and lipid coating on ability of 60-nm nanoparticles to cross aninvitromodel of the blood-brain barrier[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,1999,291(3):1017-1022.

[2] YOO H S,LEE K H,OH J E,et al.Invitroandinvivoanti-tumor activities of nanoparticles based on doxorubicin-PLGA conjugates[J].Journal of Controlled Release,2000,68(3):419-431.

[3] MA X,TIAN H.Stimuli-responsive supramolecular polymers in aqueous solution[J].Accounts of Chemical Research,2014,47(7):1971-1981.

[4] SCHMALJOHANN D.Thermo-and pH-responsive polymers in drug delivery[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2006,58(15):1655-1670.

[5] XIA Y,ZENG Y,HU D,et al.Light and pH dual-sensitive biodegradable polymeric nanoparticles for controlled release of cargos[J].Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry,2017,55(10):1773-1783.

[6] WEI H,PERRIER S,DEHN S,et al.One-pot ATRP synthesis of a triple hydrophilic block copolymer with dual LCSTs and its thermo-induced association behavior[J].Soft Matter,2012,8(37):9526-9528.

[7] SAHOO B,DEVI K S,BANERJEE R,et al.Thermal and pH responsive polymer-tethered multifunctional magnetic nanoparticles for targeted delivery of anticancer drug[J].ACS Applied Materials & Interfaces,2013,5 (9):3884-3893.

[8] CUI D,TIAN F,OZKAN C S,et al.Effect of single wall carbon nanotubes on human HEK293 cells[J].Toxicology Letters,2005,155(1):73-85.

[9] KIM S K,HEO S J,KOAK J Y,et al.A biocompatibility study of a reinforced acrylic-based hybrid denture composite resin with polyhedraloligosilsesquioxane[J].Journal of Oral Rehabilitation,2007,34(5):389-395.

[10] YANG C,DENG Y,ZENG B,et al.Hybrid amphiphilic block copolymers containing polyhedral oligomeric silsesquioxane:synthesis,characterization,and self-assembly in solutions[J].Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry,2012,50(20):4300-4310.

[11] CONNAL L A,LI Q,QUINN J F,et al.pH-responsive poly (acrylic acid) core cross-linked star polymers:morphology transitions in solution and multilayer thin films [J].Macromolecules,2008,41(7):2620-2626.

[12] JONES M,LEROUX J.Polymeric micelles:a new gene-ration of colloidal drug carriers[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,1999,48(2):101-111.

[13] POLOZOVA A,WINNIK F M.Contribution of hydrogen bonding to the association of liposomes and an anionic hydrophobically modified poly (N-isopropylacrylamide)[J].Langmuir,1999,15:4222-4229.

[14] KOGA S,SASAKI S,MAEDA H.Effect of hydrophobic substances on the volume-phase transition of N-isopropyl-acrylamide gels[J].The Journal of Physical Chemistry B,2001,105:4105-4110.