凡治國，李志平，任超

安陽市腫瘤醫(yī)院普內(nèi)科，河南 安陽455000

目前，前列腺癌的治療方式主要有內(nèi)分泌療法、化療和放療[1-2]。研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatei-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PⅠ3K/AKT）信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，能夠參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等多種生物學(xué)過程，在腫瘤細(xì)胞放療和化療的拮抗中起重要作用[3-4]。小檗堿又名黃連素，是一種季胺型異喹啉類生物堿，主要存在于小檗科、毛莫科黃連屬等植物中。小檗堿具有清熱解毒和消炎的作用，傳統(tǒng)中醫(yī)常用于治療胃腸道疾病[5]，其對糖尿病和心血管疾病等也具有較好的療效[6-7]。另外，有研究表明，小檗堿對多種腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用[8]。本研究探討了PⅠ3K抑制藥——LY294002聯(lián)合小檗堿對前列腺癌DU145細(xì)胞生長的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人前列腺癌DU145細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，小檗堿、LY294002購自Sigma公司，RPMⅠ1640培養(yǎng)基購自Ⅰnvitrogen公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco公司，PⅠ3K、p-AKT、cyclin D1、bcl-2和BAX單克隆抗體及辣根過氧化物標(biāo)記的二抗購自美國Abcam公司，MTT試劑盒購自Promega生物技術(shù)有限公司，Annexin-V-FⅠTC/PⅠ細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自生工生物工程有限公司，RNase A購自Solarbio公司，蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。CO2培養(yǎng)箱、全自動酶標(biāo)儀購自Thermo Fisher公司，倒置顯微鏡購自日本尼康公司，流式細(xì)胞儀購自Beckman Coulter公司，蛋白化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)FluorChem E購自美國Protein Simple公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出裝有前列腺癌DU145細(xì)胞的凍存管，放入37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，待細(xì)胞完全溶解后，在超凈臺中用移液槍將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至5 ml無菌離心管中，加入含有10%FBS的RPMⅠ1640細(xì)胞培養(yǎng)液，離心棄上清。加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時，用0.25%胰蛋白酶消化、離心、收集細(xì)胞，按1∶4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的DU145細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后，加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×105/孔接種于96孔板中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換為含小檗堿及LY294002的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。將細(xì)胞分為兩組：小檗堿組，用含小檗堿的細(xì)胞培養(yǎng)液單獨(dú)處理細(xì)胞；小檗堿+LY294002組，用含小檗堿和LY294002的細(xì)胞培養(yǎng)液聯(lián)合處理細(xì)胞。小檗堿組：小檗堿濃度分別為10、20、40、80 μmol/L；小檗堿+LY294002組：10 μmol/L的LY294002分別與10、20、40、80 μmol/L的小檗堿聯(lián)合作用；另外，每組均設(shè)空白對照（不加藥物處理）。培養(yǎng)48 h后，每個濃度處理組選擇6孔細(xì)胞，每孔加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液 150 μl，低速振蕩10 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，用調(diào)零孔調(diào)零。采用全自動酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定細(xì)胞的OD值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD490/對照組細(xì)胞OD490×100%。

1.2.3 Annexin V/PI熒光雙染法檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期的DU145細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，每孔2 ml接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換為分別含80 μmol/L小檗堿（小檗堿組）、10 μmol/L LY294002+80 μmol/L小檗堿（小檗堿+LY294002組）、不含LY294002和小檗堿（空白對照組）的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)6個復(fù)孔。作用48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化、PBS清洗、離心收集細(xì)胞。每孔加入500 μl Binding buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml；取1 ml細(xì)胞懸液加入10 μl Annexin V-FⅠTC和10 μl碘化丙錠（propidium iodide，PⅠ），室溫避光孵育20 min后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取數(shù)生長期的DU145細(xì)胞，用含有80 μmol/L小檗堿（小檗堿組）、10 μmol/L LY294002+80 μmol/L小檗堿（小檗堿+LY294002組）及不含LY294002和小檗堿（空白對照組）的細(xì)胞培養(yǎng)液分別處理48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。PBS洗滌后，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，4℃固定過夜。1500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，300 μl PBS重懸后，加入150 μl RNase A（10 mg/ml）和50 μl P（Ⅰ1 mg/ml），4℃避光孵育20 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)情況 取對數(shù)生長期的DU145細(xì)胞，用含有80 μmol/L的小檗堿（小檗堿組）、10 μmol/L LY294002+80 μmol/L 小檗堿（小檗堿+LY294002組）及不含LY294002和小檗堿（空白對照組）的細(xì)胞培養(yǎng)液分別處理48 h后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。加入300 μl細(xì)胞裂解液和3 μl蛋白酶抑制藥，冰上裂解30 min，離心取上清。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度，用PBS將各蛋白樣品濃度調(diào)至統(tǒng)一后與5×SDS PAGE上樣緩沖液充分混合，100℃煮沸變性5 min。配置8%的SDS蛋白凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出蛋白凝膠，4℃轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%BSA封閉后，TBST洗滌3次，然后依次與一抗（500倍稀釋）、二抗（100倍稀釋）孵育后，滴加化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色，用蛋白化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對DU145細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測不同濃度的小檗堿單用及與10 μmol/L的LY294002聯(lián)用處理DU145細(xì)胞48 h后，對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示：小檗堿組中，10、20、40、80 μmol/L小檗堿分別處理后DU145細(xì)胞的增殖率均較空白對照（0 μmol/L小檗堿）低，且隨著小檗堿作用濃度的增加，細(xì)胞增殖率逐漸降低，呈劑量依賴性。10、20、40、80 μmol/L小檗堿與10 μmol/L的LY294002聯(lián)用后，對DU145細(xì)胞增殖的抑制作用較相同濃度小檗堿單獨(dú)處理時增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對DU145細(xì)胞增殖的影響

2.2 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對DU145細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測80 μmol/L小檗堿單用及與10 μmol/L LY294002聯(lián)用處理DU145細(xì)胞48 h后，對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：小檗堿組、小檗堿+LY294002組、空白對照組DU145細(xì)胞的凋亡率分別為（27.50±1.25）%、（39.47±3.65）%、（7.56±0.51）%。與空白對照組相比，小檗堿組DU145細(xì)胞的凋亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。小檗堿與LY294002聯(lián)用后，對DU145細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)，與小檗堿組和空白對照組相比，小檗堿+LY294002組DU145細(xì)胞的凋亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對DU145細(xì)胞凋亡的影響

2.3 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對DU145細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測80 μmol/L小檗堿單用及與10 μmol/L LY294002聯(lián)用處理DU145細(xì)胞48 h后，對DU145細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，小檗堿組的G0/G1期DU145細(xì)胞所占比例升高，S期DU145細(xì)胞所占比例降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白對照組與小檗堿組的G2/M期DU145細(xì)胞所占比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。小檗堿與LY294002聯(lián)用后，對DU145細(xì)胞周期的阻滯作用增強(qiáng)，與小檗堿組和空白對照組相比，小檗堿+LY294002組G0/G1期細(xì)胞所占比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對DU145細(xì)胞周期的影響（%，±s）

表1 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對DU145細(xì)胞周期的影響（%，±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.05；b與小檗堿單獨(dú)處理組比較，P＜0.05

組別空白對照組（n=6）小檗堿組（n=6）小檗堿+LY294002組（n=6）42.31±3.48 61.56±5.21a 74.19±5.69a b 24.48±2.19 20.81±2.94 17.59±2.76 33.21±3.18 17.63±2.51a 8.22±1.98a G0/G1期G2/M期S期b

2.4 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對PI 3 K和p-AKT蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測DU145細(xì)胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示：空白對照組DU145細(xì)胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白均呈高表達(dá)；小檗堿組DU145細(xì)胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平均較空白對照組下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；小檗堿+LY294002組DU145細(xì)胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平均較小檗堿組和空白對照組下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖3）

圖3 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對ⅠP 3 K和p-AKT蛋白表達(dá)的影響

2.5 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對cyclin D 1、bcl- 2和BAX蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測DU145細(xì)胞中cyclin D1、bcl-2和BAX蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：小檗堿組DU145細(xì)胞中cyclin D1和bcl-2蛋白表達(dá)水平均較空白對照組下調(diào)，BAX蛋白表達(dá)水平均較空白對照組上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與小檗堿組和空白對照組相比，小檗堿+LY294002組DU145細(xì)胞中cyclin D1和bcl-2蛋白表達(dá)均下調(diào)，BAX蛋白表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖 4）

圖4 小檗堿單用及與LY294002聯(lián)用對cyclin D 1、bcl- 2和BAX蛋白表達(dá)的影響

3 討論

小檗堿是主要存在于小檗科、毛莫科等植物中的季胺型異喹啉類生物堿，具有清熱解毒和消炎的作用，傳統(tǒng)中醫(yī)常用于治療胃腸道疾病，能夠通過改善胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及減輕炎性反應(yīng)發(fā)揮抗代謝紊亂的作用[9]。近年來研究表明，小檗堿具有抗腫瘤作用，如在宮頸癌中，李娜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外增殖，減弱細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。溫純潔[11]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以協(xié)同他莫昔芬抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MCF-7/TAM細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞G1期阻滯，從而抑制乳腺癌的生長。此外，小檗堿還能在胃癌[12]、肺癌[13]、結(jié)腸癌[14]等多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)以前列腺癌DU145細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，研究了小檗堿對DU145細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示10、20、40、80 μmol/L的小檗堿均能夠抑制DU145細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性。進(jìn)一步用80 μmol/L小檗堿研究其對DU145細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示小檗堿能夠誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡，并將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，說明小檗堿能夠抑制DU145細(xì)胞的生長。

已有研究證實(shí)多條信號通路參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如MAPK信號通路[15]、JAK/STAT信號通路、NF-κB信號通路[16]等。PⅠ3K/AKT屬于酪蛋白激酶受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，近年來研究表明，PⅠ3K/AKT信號通路在細(xì)胞的增殖及血管生成中具有重要作用，PⅠ3K/AKT信號通路激活能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長、抑制細(xì)胞的凋亡，與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[17]。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，抑制PⅠ3K/AKT信號通路能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞對放療及化療的敏感性[18]。本研究采用PⅠ3K抑制藥——LY294002抑制PⅠ3K/AKT信號通路，發(fā)現(xiàn)LY294002與小檗堿聯(lián)用能夠提高小檗堿對DU145細(xì)胞增殖的抑制作用，同時能夠提高DU145細(xì)胞的凋亡率及對細(xì)胞周期阻滯情況，提示抑制PⅠ3K/AKT信號通路能夠提高小檗堿對前列腺癌的治療效果。本研究還采用Western blot法檢測了DU145細(xì)胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，小檗堿能夠抑制PⅠ3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平，說明小檗堿能夠抑制PⅠ3K/AKT信號通路的激活；當(dāng)LY294002與小檗堿聯(lián)用后，與小檗堿單獨(dú)作用時相比，PⅠ3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，表明LY294002能夠增強(qiáng)小檗堿對PⅠ3K/AKT信號通路的抑制作用。

cyclin D1是重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，目前研究顯示，cyclin D1過表達(dá)能夠造成細(xì)胞異常增殖及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[19]。bcl-2基因家族在通過線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡中具有重要的作用，其中bcl-2的主要功能是抑制細(xì)胞凋亡，BAX的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，bcl-2和BAX能夠形成異源或同源二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[20]。本研究采用Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠抑制DU145細(xì)胞中cyclin D1和bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)BAX蛋白的表達(dá)，表明小檗堿影響DU145細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期與其能夠調(diào)控cyclin D1、bcl-2和BAX蛋白的表達(dá)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小檗堿與LY294002聯(lián)用后，DU145細(xì)胞中cyclin D1和bcl-2蛋白表達(dá)均下調(diào)，BAX蛋白表達(dá)上調(diào)，與小檗堿單獨(dú)處理時相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，小檗堿能夠抑制DU145細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，采用LY294002阻斷PⅠ3K/AKT信號通路能夠明顯增強(qiáng)小檗堿對前列腺癌DU145細(xì)胞生長的抑制作用。

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